Одномолекулярное измерение динамики взаимодействия белков в биомолекулярных конденсатах
5 января 2024 г.
Было показано, что многие внутренне неупорядоченные белки участвуют в образовании высокодинамичных биомолекулярных конденсатов, что важно для многих клеточных процессов. В данной работе мы представляем метод количественной оценки динамики, с помощью которой белки взаимодействуют друг с другом в биомолекулярных конденсатах в живых клетках, основанный на визуализации одной молекулы.
1 Целью нашей лаборатории является понимание взаимодействий2 внутренне неупорядоченных белковых областей 3 и их роли в регуляции транскрипции 4 в здоровых и больных клетках человека. 5 В нашей лаборатории мы разрабатываем и используем новые 6 методы одномолекулярной микроскопии 7 в сочетании с молекулярной биологией, 8 биохимическим и протеомным подходами 9 для изучения биомолекулярных конденсатов. 10 Этот протокол позволяет количественно оценить динамику 11, с помощью которой Белок 12 связывается с определенным типом конденсата 13 в живых клетках человека14 и широко применим 15 для измерения динамики взаимодействия любого белка 16, который участвует в разделении жидкой и жидкой фаз.
Обзор
В данном исследовании изучается динамика внутренне неупорядоченных белков при формировании биомолекулярных конденсатов, которые играют ключевую роль в клеточных процессах. С помощью современных методов визуализации отдельных молекул в работе количественно оценивается взаимодействие белков внутри конденсатов в живых клетках человека.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Внутренне неупорядоченные белки
- Биомолекулярные конденсаты
- Одномолекулярная визуализация
Теоретические основы
- Значение белковых взаимодействий в клеточной регуляции
- Роль разупорядоченных белков в фазовом разделении
- Новые методы изучения клеточной динамики
Используемые методы
- Микроскопия одиночных молекул
- Экспрессия белков с Halo-тегом в клетках человека
- Методы визуализации живых клеток
Основные результаты
- Количественная оценка белковых взаимодействий в конденсатах
- Измерение среднего времени пребывания белков
- Различия в динамике связывания между разными белковыми конструкциями
Выводы
- В данном исследовании разъясняется динамика взаимодействия разупорядоченных белков в клеточных конденсатах.
- Полученные результаты имеют значение для понимания транскрипционной регуляции в норме и при патологиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное измерение динамики белковых взаимодействий внутри биомолекулярных конденсатов решает критическую задачу на ранних этапах поиска: понимание транзиторных многовалентных взаимодействий, которые определяют фазовое разделение в живых клетках. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и снижает риски при выдвижении механистических гипотез для путей, имеющих значение для заболеваний. Данный подход поддерживает принятие решений по портфелю препаратов, позволяя проводить прямое сравнение поведения белкового связывания при различных молекулярных конфигурациях.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямое количественное определение времени пребывания белков внутри конденсатов, что проясняет функциональное взаимодействие с мишенью.
- Способствует механистическому снижению рисков путем разграничения динамики связывания вариантов белков или слитых конструкций.
- Облегчает проверку гипотез относительно внутренне неупорядоченных областей белков в системах, имеющих значение для патологий.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные рабочие процессы визуализации живых клеток для последующего скрининга модуляторов, влияющих на динамику конденсатов.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты (среднее время пребывания) для стандартизации и бенчмаркинга анализа.
- Позволяет проводить надежное сравнение влияния химических соединений или генетических пертурбаций на взаимодействия белков с конденсатами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям заболеваний за счет измерения динамики белков в живых клетках человека.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров, связывая кинетику молекулярных взаимодействий с функциональными результатами.
- Оптимизирует продвижение с учетом рисков, предоставляя механистические данные о поведении белков в физиологически релевантных условиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод визуализации отдельных молекул интегрируется в общий процесс исследований — от ранней валидации мишеней до доклинических испытаний, предоставляя многократно используемую платформу для изучения механизмов действия и проведения скрининга.
- Открывающая биология: количественное определение времени удерживания при связывании для проверки гипотез о функции белков в формировании конденсатов.
- Скрининг: предоставление стандартизированных количественных показателей для оценки нарушений взаимодействий между белками и конденсатами.
- Аналитика: получение измерений на основе траекторий и статистических данных для надежного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: установление связи между динамикой молекулярных взаимодействий и клеточными моделями, имеющими значение для заболеваний.
- Применение в масштабах организации: предложение широко применимого рабочего процесса для различных белков, участвующих в LLPS.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогнозах при валидации мишеней и уменьшает неопределенность в механизмах действия на ранних этапах поиска лекарственных средств.
- Операционная ценность: стандартизирует визуализацию и анализ живых клеток для воспроизводимой и масштабируемой генерации данных.
- Стратегическая ценность: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет уточнения взаимодействия с мишенью.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию с учетом рисков на основе количественных механистических данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации отдельных молекул в живых клетках и анализа траекторий.
- Необходима современная инфраструктура микроскопии и вычислительные средства для обработки данных.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров визуализации и анализа.
- Метод adaptable к различным белкам-мишеням и клеточным моделям при использовании соответствующих стратегий мечения.
- Коррекция фотообесцвечивания и фильтрация траекторий необходимы для точного измерения времени пребывания.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:40
Halo‐Ligand Staining of Cells for Protein Condensate‐Interaction Studies Using Single‐Molecule Imaging
1:31
Single‐Molecule Imaging of Halo‐Tagged Proteins to Study Protein‐Condensate Interactions
3:25
Analysis of Single‐Molecule Imaging Data to Study Interactions of Halo‐Tagged Proteins
