Скрининг малых молекул и тестирование токсичности личинок данио-рерио на ранних стадиях
7 марта 2025 г.
Этот протокол описывает процедуру скрининга лекарственных средств у личинок рыбок данио через 3-7 дней после оплодотворения с последующей морфологической оценкой.
Для начала соберите эмбрионы данио-рерио на ранних стадиях через три дня после оплодотворения в чашке Петри. С помощью микропипетки объемом 1000 микролитров, установленной на 100 микролитров, перенесите по одному здоровому на вид вылупившемуся эмбриону в каждую лунку планшета на 96 лунок. Теперь нанесите пипеткой необходимое количество исследуемого химического вещества в каждую лунку 12-луночного планшета.
Затем отрегулируйте общий объем до 2,4 миллилитра со средой Е3. Подготовьте систему управления автомобилем в соответствии с растворителем, используемым для растворения стандартного испытательного химиката. С помощью пипетки объемом 200 микролитров удалите любой существующий раствор E3 из каждой лунки планшета на 96 лунок.
Используйте восьмиканальный микропипетку, чтобы заменить его 100 микролитрами подготовленной исследуемой среды для каждой концентрации. Убедитесь, что в общей сложности проверяется 24 личинки на одну концентрацию. Через 24 часа используйте стереосветовой микроскоп для проведения морфологической оценки.
Оцените морфологию с помощью бинарного метода, где absent указывает на нормальную морфологию, а present указывает на морфологическую аномалию. Когда забивка будет завершена, удалите по 50 микролитров среды из каждой лунки. Замените его 50 микролитрами свежеприготовленной тестовой среды.
Удалите и запишите все мертвые личинки, затем инкубируйте личинок при температуре 28,5 градусов Цельсия с 14-часовым световым и 10-часовым темным циклом. Рыбки данио через пять дней после оплодотворения демонстрировали различные фенотипы после двух дней воздействия препарата. Непораженные рыбы данио наблюдались в норме, в то время как у некоторых рыб наблюдался легкий отек перикарда.
У других отмечен выраженный отек перикарда, сопровождающийся кровотечением из желтка и удлинением желтка. Также наблюдалась задержка развития с уменьшением пигментации, плавательного пузыря и общей длины. Дополнительные фенотипы включали рыбок данио с вздутым желтком и изогнутым хвостовым плавником, отсутствующим хвостовым плавником и изогнутой хордой.
В тяжелых случаях наблюдалось усечение и смерть с некрозом.
Обзор
В данном исследовании представлен протокол скрининга лекарственных препаратов на личинках zebrafish в возрасте 3–7 дней после оплодотворения с акцентом на морфологическую оценку после воздействия препаратов. Целью работы является анализ различных фенотипических результатов, вызванных воздействием различных химических соединений.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Скрининг лекарственных препаратов
- Биология развития
- Зебрафиш как модельные организмы
Теоретические сведения
- Личинки данио-рерио представляют большую ценность для оценки влияния лекарственных препаратов на развитие.
- Морфологическая оценка позволяет выявить фенотипы, индуцированные действием препаратов.
- Понимание этих эффектов может помочь в скрининге токсичности и фармакологических исследованиях.
Используемые методы
- Воздействие препарата в контролируемой среде.
- Личинки данио-рерио (Zebrafish) в качестве биологической системы.
- Морфологическая оценка с использованием стереомикроскопа.
Основные результаты
- Различные фенотипы, наблюдаемые после воздействия препарата, включая нормальную морфологию, перикардиальный отек от легкого до тяжелого и задержки развития.
- Были зафиксированы специфические отклонения, такие как отсутствие плавательного пузыря и измененная морфология плавников.
- Продемонстрировано влияние химической обработки на развитие zebrafish.
Выводы
- Данное исследование демонстрирует использование zebrafish для оценки влияния лекарственных препаратов на развитие.
- Полученные результаты способствуют пониманию химической токсичности и ее значения для биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Стандартизированный скрининг малых молекул и тестирование токсичности на ранних стадиях развития личинок zebrafish позволяют восполнить критический пробел в доклинической оценке безопасности. Данный протокол обеспечивает воспроизводимую количественную оценку морфологических изменений, вызванных соединениями, что повышает прогностическую точность на ранних этапах разработки лекарственных средств. Интеграция надежных данных о токсичности, полученных на модели zebrafish, способствует эффективному отбору кандидатов для портфеля и снижает риски на последующих этапах разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность быстрого анализа токсичности соединений на модельном организме позвоночных.
- Способствует снижению биологических рисков за счет раннего выявления нарушений развития.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней с помощью наблюдаемых фенотипических результатов.
- Повышает прогностическую уверенность при дальнейшем продвижении химических серий.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает стандартизированный, масштабируемый рабочий процесс для высокопроизводительного скрининга токсичности.
- Обеспечивает воспроизводимые, количественно определяемые морфологические конечные точки для разработки анализа.
- Обеспечивает готовность к скринингу путем определения оптимальных форматов планшетов и условий экспозиции.
- Позволяет проводить надежное сравнение эффектов соединений между разными партиями и исследованиями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет ранние результаты исследований токсичности с трансляционными биомаркерами безопасности.
- Обеспечивает преемственность процесса от этапа поиска до доклинической оценки рисков.
- Позволяет принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении препарата на основе данных, полученных на моделях позвоночных.
- Снижает процент неудач на поздних стадиях разработки за счет раннего выявления веществ, обладающих developmental toxicity.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный протокол с использованием zebrafish находится на стыке этапов первичного поиска и доклинических исследований безопасности, связывая скрининг in vitro и валидацию на моделях млекопитающих.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез о безопасности соединений и их воздействии на развитие.
- Скрининг: Предоставляет стандартизированные, воспроизводимые показатели токсичности, подходящие для высокопроизводительных рабочих процессов.
- Аналитика: Предоставляет бинарные и количественные морфологические данные для надежного статистического анализа.
- Трансляционные исследования: Обеспечивают раннюю корреляцию с конечными точками безопасности позвоночных, имеющими значение для рисков у человека.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизация протокола позволяет внедрять его в различных программах и на разных площадках для обеспечения согласованной оценки безопасности.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность при предварительной оценке безопасности.
- Операционная ценность: улучшает воспроизводимость, масштабируемость и стандартизацию анализа в группах по поиску новых соединений.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективно управлять портфелем с точки зрения затрат капитала.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению более безопасных химических соединений.
Особенности реализации
- Требуется опыт в содержании zebrafish и морфологической оценке.
- Необходим доступ к инфраструктуре для работы с многолуночными планшетами и стереомикроскопии.
- Требуется согласование критериев оценки и параметров экспозиции между исследовательскими группами.
- Метод применим к различным классам соединений, но ограничен конечными точками оценки токсичности на ранних стадиях развития.
- Надежная интерпретация бинарных и количественных данных зависит от строгого статистического анализа.
