Руководство маленькая молекула экрана Подойдя высокой пропускной Использование эмбрионов данио

Общая цель данного эксперимента заключается в проведении химического скрининга эмбрионов рыб данио с использованием ручной обработки образцов. Это достигается путем помещения взрослых рыб данио в брачные камеры с разделителем на ночь, а затем удаления разделителя на следующее утро для сбора эмбрионов. Затем группы эмбрионов рыбок данио ранжируются в 96 луночных планшетов, а затем обрабатываются препаратом на желаемой стадии развития.

Затем эмбрионам дают развиваться с фиксированным 4% паральдегидом и анализируют для оценки влияния малых молекул на интересующий процесс развития. Результаты показывают изменения в развитии, такие как увеличение или потеря доменов экспрессии генов, которые могут указывать на изменения в сульфате или морфогенезе тканей, вызванные малыми молекулами, которые были исследованы. Применение этого метода распространяется на клиническое лечение различных заболеваний из-за способности идентифицировать потенциально терапевтические соединения.

Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, могут испытывать трудности, потому что им необходимо приобрести ловкость, необходимую для работы с эмбрионами, например, для переноса их между многолуночными планшетами без повреждений. Демонстрировать эту процедуру будем я и Эрик Донахью, студент-исследователь в лаборатории по организации спаривания рыб данио. Используйте брачные камеры с разделителями, поместите взрослых самцов рыбок данио с одной стороны перегородки, а взрослых самок рыбок данио с другой стороны.

На каждые 96 лунок проводится тестирование пластин с малыми молекулами. Установите 25 емкостей для сопряжения и оставьте их на ночь. На следующий день снимите камеру, которая разделяет каждую пару рыб, и через час используйте мелкоячеистое ситечко для сбора эмбрионов перед тем, как поместить их в чашки Петри, содержащие среду Е-3, с помощью трансферной пипетки.

Удалите мусор с пластин и под стереоскоп. Наблюдайте за каждой кладкой эмбрионов и удаляйте все неоплодотворенные яйца. Сцедите Е три средних и замените свежими Е три.

Затем поместите каждую чашку с эмбрионами в инкубатор с температурой 28,5 градусов Цельсия на два часа. Еще раз проверьте пластины и выбросьте все дополнительные неоплодотворенные яйца. Продолжайте инкубацию эмбрионов до стадии 40%.

Снимите пластину с химической библиотекой при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Накройте его алюминиевой фольгой и дайте ему оттаять при комнатной температуре с помощью восьмиканальной пипетки. Добавьте 99 микролитров Е три в столбцы со второго по 12 из 96-луночного планшета.

Затем добавьте по одному микролитру соответствующих соединений в лунки в столбцах со второй по 11 здесь, обозначенные в качестве экспериментальных образцов пипеткой один микролитр ДМСО, в контрольную колонку, предназначенную здесь для столбца 12. Используйте алюминиевую фольгу, чтобы покрыть пластину для разбавления, и верните исходную химическую библиотеку в морозильную камеру. Затем, после выбора чашки Петри, содержащей эмбрионы на стадии 40% эпи, с помощью пипетки для переноса осторожно поместите около 10 эмбрионов в лунку в столбцы со второй по 12 из 96.

Колодец пластина. С помощью стеклянной переводной пипетки удалите избыток Е-три из каждой лунки и вытолкните в контейнер для жидких отходов. Чтобы химически обработать эмбрионы, перелейте по 100 микролитров каждого химического разведения из 96-луночного планшета в соответствующую лунку с эмбрионами, чтобы создать влажную камеру с помощью бумажного полотенца, и поместите его в светочувствительный контейнер.

Достаточно большой, чтобы вместить пластину на 96 лунок. Затем используйте потолочный коврик для герметизации плиты. Поместите его в светочувствительный контейнер и инкубируйте при температуре 28,5 градусов Цельсия в течение желаемого периода времени.

Чтобы удалить химикаты, добавьте по 300 микролитров Е три в каждый ряд обработанных препаратом лунок. Затем стяните среду перед использованием Е три, промойте эмбрионы три раза, чтобы закрепить зародыши, переложите их в четыре помеченные 24 луночные пластины, расположив пипетку перед темным фоном. После каждой лунки пересадки для выявления оставшихся в пипетке эмбрионов и для предотвращения кроссинговера, удаления всех мертвых эмбрионов.

Оттяните Е три так, чтобы эмбрионы едва погрузились в жидкость. Затем с помощью стеклянной пипетки добавьте две капли по 50 мг на миллилитр проназы в каждую. Хорошо инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут, прежде чем взбалтывать лунки, чтобы кориан раскололся.

После использования Е три для промывания эмбрионов дважды, снимите и выбросьте оставшийся Е три. Добавьте 4% P-F-A-P-B-S в каждую лунку и инкубируйте эмбрионы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Затем проведите интересующий вас скрининг, такой как гибридизация in situ, или пожелание, как указано в текстовом протоколе, получить оценку эмбрионов с помощью химического скрининга.

Перенесите их на маркированные 12-луночные планшеты, прежде чем использовать стереомикроскоп для их наблюдения, как показано на этой схеме. Для одного человека целесообразно провести химико-генетический скрининг примерно 600 соединений в течение девяти недель целенаправленных усилий, и это время может быть сокращено до трех недель, если его проводят три человека. Таким образом, рабочее время одного или нескольких человек может обойти потребность в оборудовании с высокими требованиями к ресурсам, таком как автоматизированные системы.

Как показано на рисунке, эмбрионы рыб данио подвергались воздействию отдельных соединений из биоактивной библиотеки от 50% до 24 HPF, а затем анализировались по желанию с использованием коктейля из трех зондов рибо для обнаружения сегментов нефрона. В качестве примера, системы классификации, соединение, которое привело к значительному увеличению проксимального извитого канальца или ПКТ, будет классифицироваться как класс один, который представляет класс, связанный с наиболее серьезным дефектом и самым высоким уровнем достоверности наблюдаемого фенотипа. В этом случае соединение будет аннотировано как РСТ первого класса.

Кроме того, эта классификация обеспечивает простой и быстрый способ описать небольшую молекулу, представляющую интерес, включая степень ее воздействия на организм, область, на которую влияет лекарство, и способ, которым эта область воздействует. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о том, что эмбрионы должны быть выращены в правильный момент развития. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить ручной химический скрининг эмбрионов рыбок данио.