3D-визуализация с высоким разрешением без меток и машинное обучение для анализа кишечных органоидов с помощью низкокогерентной голотомографии
August 12th, 2025
Мы представляем пошаговый протокол для получения трехмерной визуализации органоидов с высоким разрешением, без меток и с использованием низкокогерентной голотомографии. Этот протокол подробно описывает подготовку органоидных культур, получение изображений и вычислительный анализ изображений, что позволяет в режиме реального времени визуализировать структурную динамику и реакцию лекарств в живых органоидах.
Мы стремимся создать методы визуализации в режиме реального времени без меток при мониторинге биофизических изменений в живых органоидах во время разработки и в ответ на лекарственные препараты. Этот протокол способствует упрощению масштабирования визуализации и неинвазивного тестирования лекарств на живых органоидах, поддерживаемых мутациями, управляемыми искусственным интеллектом, и количественным отбором текстуры для биомедицинских исследований. Мы планируем дальнейшую интеграцию 3D-визуализации без меток и годичного анализа для исследований неинвазивных органоидов с высоким разрешением в моделировании заболеваний и точной медицине.
Для начала отсасывайте отработанную среду из каждой лунки 48-луночного планшета, содержащего внеклеточный матрикс. Добавьте по 200 микролитров раствора для восстановления клеток в каждую лунку и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. С помощью пипетки аккуратно соберите органоидную суспензию и переложите ее в микроцентрифужную пробирку.
Центрифугируйте пробирку при 150г в течение трех минут, затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Чтобы механически диссоциировать гранулу, суспендируйте в 200 микролитрах питательной среды и пипетируйте суспензию вверх и вниз от 20 до 30 раз с помощью пипетки P200 перед центрифугированием в течение трех минут. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости добавьте в гранулу средний и свежий внеклеточный матрикс, или ВКМ, в соотношении один к четырем и аккуратно пипеткой тщательно перемешайте.
Выдайте по 15 микролитров смеси на купол в каждую лунку 48-луночного планшета. Поместите пластину вверх дном в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на один час, чтобы обеспечить полимеризацию ECM. После полимеризации добавьте в каждую лунку по 200 микролитров свежей питательной среды, а пустые наружные лунки заполните PBS.
Чтобы подготовить образец к визуализации, нанесите 15 микролитров органоидного купола ECM на чашку для визуализации с покровным стеклом номер 1,5 и инкубируйте его при комнатной температуре в течение одной минуты. Поместите тарелку вверх дном в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Затем аккуратно добавьте достаточное количество питательной среды, чтобы полностью погрузить органоиды.
Через пять дней после пассажа промойте образец два-три раза PBS непосредственно перед визуализацией. Далее для визуализации включите контроллер окружающей среды. Блок контроллера камеры автоматически установит температуру на 37 градусов по Цельсию и углекислый газ на 5% Нажмите кнопку «Дверь», чтобы открыть дверь.
Добавьте воду, чтобы внутри камеры образовался тонкий слой. Поместите чашку для визуализации в держатель сосуда, вставьте ее в камеру визуализации и закрепите ее с помощью штифта, чтобы предотвратить движение. Закройте дверцу, чтобы предотвратить внешние световые помехи.
Теперь запустите программу TomoStudio X и войдите в систему. Нажмите кнопку Пуск, чтобы открыть главное окно, а затем нажмите кнопку Добавить проект в верхнем левом углу и назначьте эксперимент. Убедитесь, что выбран правильный тип среды для правильного использования показателя преломления.
Нажмите на нужный колодец на панели, а затем нажмите кнопку «Создать» вверху, чтобы зарегистрировать колодец в качестве образца. Затем нажмите «Настройка ROI» в правом верхнем углу, чтобы определить область интереса в блюде. После настройки нажмите «Запустить эксперимент» в правом нижнем углу, чтобы открыть окно «Получение изображений».
Нажмите кнопку «Загрузить судно» в углу, чтобы отобразить яркое изображение поля. Отрегулируйте положение Z с помощью кнопок Z и Z, чтобы сфокусировать изображение. На вкладке «Одно изображение» настройте размер ROI.
Захватывайте органоиды в поле зрения 160 микрометров на 160 микрометров и получайте стеки глубиной до 140 микрометров. Перейдите на вкладку «Интервальная съемка», чтобы настроить долгосрочную визуализацию и установить желаемую продолжительность и интервал времени. Щелкните значок Сканировать, чтобы зафиксировать текущее местоположение ROI.
Нажмите кнопку BF, чтобы настроить значения интенсивности и экспозиции для получения изображений в светлом поле. Переместите поле ROI на панели Предварительный просмотр, чтобы выбрать ROI. После выбора желаемого ROI нажмите «Добавить точку» внизу, и список точек визуализации будет создан.
Теперь нажмите «Получить», чтобы начать создание изображений и получить необработанные данные изображения. Запустите сервер обработки HTX, щелкнув значок рабочего стола. Перетащите файлы необработанных изображений на сервер обработки HTX.
Нажмите кнопку «Обработать», чтобы создать файл TCF из файла необработанного изображения. Запустите средство просмотра TomoAnalysis, щелкнув значок рабочего стола. Загрузите обработанные файлы TCF, перетащив их в окно просмотрщика.
Дважды щелкните миниатюру файла, чтобы открыть томограмму ROI. Изучайте 2D-вид, перемещаясь по плоскостям X, Y, Z с помощью элементов управления масштабированием, панорамированием и прокруткой. Щелкните значок вида визуализации MIP слева, чтобы переключиться в режим 3D-визуализации.
Перемещайтесь по 3D-виду, поворачивая, масштабируя и панорамируя изображение. Для сегментации изображений на основе машинного обучения экспортируйте файл изображения TCF в формат HDF5, чтобы убедиться, что данные представлены в многомерном формате, совместимом с ilastik. Откройте ilastik и перейдите в раздел «Новый проект».
Выберите «Классификация пикселей» в разделе «Рабочий процесс сегментации» и сохраните проект в указанной папке. Чтобы загрузить файл HGF5, перейдите на вкладку Входные данные, нажмите Добавить новый файл, выберите соответствующий набор данных H5 и проверьте правильное назначение каналов изображения. Теперь перейдите на вкладку Выбор объектов, чтобы выбрать такие характеристики, как цвет, интенсивность, края и текстура для оптимизации сегментации.
На вкладке «Тренировка» обозначьте органоидные и неорганоидные области мазками кисти разных цветов. Нажмите «Обновление в реальном времени», чтобы просмотреть результаты сегментации и при необходимости внести коррективы. После этого перейдите на вкладку «Экспорт прогнозов».
Выберите Простая сегментация в качестве источника для экспорта помеченных прогнозов и нажмите кнопку Экспортировать все. Установите формат экспорта H5 или TIFF в зависимости от требований анализа. Для количественного анализа откройте файл дополнительного кодирования 2.
Назначьте соответствующие пути к папкам для файла маски и соответствующего файла TCF в сценарии. Запустите код, чтобы начать количественный анализ. Код рассчитает объем органоидов, плотность белка и общее содержание белка для каждого набора данных.
На этом рисунке показана трехмерная реконструкция с высоким разрешением, используемая для визуализации общей морфологии органоидов тонкого кишечника. Визуализированные реконструкции показывают явные структурные различия между органоидами, обработанными транспортным средством и цисплатином, на всех трех глубинах оптического сечения. Органоиды, обработанные цисплатином, показали значительно больший объем, меньшую плотность белка и более высокое общее содержание белка по сравнению с органоидами, обработанными носителями, через 10 минут после обработки, что указывает на раннее структурное набухание и изменение белкового состава.
Покадровая визуализация в течение 24 часов показала, что органоиды, обработанные носителем, сохраняют структурную целостность, в то время как органоиды, обработанные цисплатином, испытывают прогрессирующую структурную деградацию, включая коллапс крипты и повышенную диссоциацию клеток, что предполагает зависимое от времени цитотоксическое повреждение. Количественное отслеживание подтвердило, что органоиды, обработанные носителями, увеличивались в объеме и содержании белка с течением времени, в то время как органоиды, обработанные цисплатином, показали зависимое от времени снижение обоих параметров, что указывает на то, что цисплатин подавляет рост и индуцирует клеточную деградацию. Плотность белка оставалась стабильной в органоидах, обработанных носителями, но постепенно снижалась в органоидах, обработанных цисплатином, в течение 24-часового периода, что свидетельствует о разрушении клеточной структуры и увеличении внеклеточного пространства из-за отшелушивания.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Это исследование представляет протокол для высокоразрешенного, безметочного, трехмерного визуализации органоидов, что облегчает реальное время визуализации структурной динамики и реакции на лекарства. Метод использует голотомографию с низкой когерентностью, улучшая возможность мониторинга биофизические изменений во время развития органоидов.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Биология органоидов
- Техники биомедицинского имэджи
- Анализ реакции на лекарства
Фон
- Важность неинвазивной визуализации в живых органоидах
- Использование ИИ в количественной селекции текстуры
- Значимость в моделировании заболеваний и точной медицине
Использованные методы
- Голотомография для визуализации органоидов
- Живые культуры органоидов
- ИИ-ориентированный количественный анализ данных имэджи
Основные результаты
- Успешная визуализация структур органоидов в реальном времени
- Возможность оценивать реакции на лекарства без инвазии
- Демонстрация интеграции с вычислительным анализом для получения улучшенных знаний
Выводы
- Метод демонстрирует новый подход к высокоразрешенной визуализации органоидов.
- Он предоставляет важные знания о биофизических свойствах и воздействии лекарств в живой биологической среде.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Label-free, high-resolution 3D imaging of intestinal organoids using low-coherence holotomography enables real-time, quantitative assessment of organoid morphology and drug response without phototoxicity or sample perturbation. Integration with machine learning segmentation delivers scalable, unbiased analysis of viability and structural changes, supporting predictive confidence in early discovery and preclinical research. This workflow enhances translational continuity and de-risks mechanistic evaluation for organoid-based disease modeling and pharmaceutical screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables non-invasive, quantitative interrogation of organoid growth and viability under experimental conditions.
- Supports mechanistic de-risking by tracking real-time morphological and biophysical changes in response to candidate compounds.
- Facilitates functional target validation through unbiased, label-free monitoring of organoid structure and protein content.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible imaging outputs for high-throughput compound screening in organoid systems.
- Delivers quantitative metrics such as volume, protein density, and content to support assay development and optimization.
- Enables scalable, machine learning-driven segmentation for consistent feature extraction across large datasets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant organoid models for translational biomarker discovery and drug response profiling.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal, real-time tracking of organoid responses.
- Reduces biological ambiguity in preclinical decision-making by providing quantitative, time-resolved readouts of cytotoxicity and structural integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, screening, and preclinical research by providing a unified, label-free imaging and analysis platform for organoid-based studies.
- Discovery Biology: Quantitative, real-time imaging supports hypothesis testing and mechanistic pathway clarification in organoid models.
- Screening: Machine learning segmentation and quantitative outputs enable reproducible, high-throughput screening workflows.
- Analytics: Provides volumetric, protein density, and content measurements for robust comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and supports biomarker-driven evaluation of drug effects.
- Enterprise Reuse: Adaptable across organoid systems, supporting broad implementation and portfolio-wide standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in organoid-based assays.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging and analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling early, quantitative assessment of drug effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust, translationally relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, advanced imaging, and machine learning-based segmentation.
- Demands access to low-coherence holotomography instrumentation and computational analysis infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various organoid systems but may require optimization for specific tissue types or experimental endpoints.
- Dependent on robust data management and integration with downstream analytics for high-throughput studies.
