3D-визуализация с высоким разрешением без меток и машинное обучение для анализа кишечных органоидов с помощью низкокогерентной голотомографии
12 августа 2025 г.
Мы представляем пошаговый протокол для получения трехмерной визуализации органоидов с высоким разрешением, без меток и с использованием низкокогерентной голотомографии. Этот протокол подробно описывает подготовку органоидных культур, получение изображений и вычислительный анализ изображений, что позволяет в режиме реального времени визуализировать структурную динамику и реакцию лекарств в живых органоидах.
Мы стремимся создать методы визуализации в режиме реального времени без меток при мониторинге биофизических изменений в живых органоидах во время разработки и в ответ на лекарственные препараты. Этот протокол способствует упрощению масштабирования визуализации и неинвазивного тестирования лекарств на живых органоидах, поддерживаемых мутациями, управляемыми искусственным интеллектом, и количественным отбором текстуры для биомедицинских исследований. Мы планируем дальнейшую интеграцию 3D-визуализации без меток и годичного анализа для исследований неинвазивных органоидов с высоким разрешением в моделировании заболеваний и точной медицине.
Для начала отсасывайте отработанную среду из каждой лунки 48-луночного планшета, содержащего внеклеточный матрикс. Добавьте по 200 микролитров раствора для восстановления клеток в каждую лунку и инкубируйте при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. С помощью пипетки аккуратно соберите органоидную суспензию и переложите ее в микроцентрифужную пробирку.
Центрифугируйте пробирку при 150г в течение трех минут, затем осторожно удалите надосадочную жидкость. Чтобы механически диссоциировать гранулу, суспендируйте в 200 микролитрах питательной среды и пипетируйте суспензию вверх и вниз от 20 до 30 раз с помощью пипетки P200 перед центрифугированием в течение трех минут. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости добавьте в гранулу средний и свежий внеклеточный матрикс, или ВКМ, в соотношении один к четырем и аккуратно пипеткой тщательно перемешайте.
Выдайте по 15 микролитров смеси на купол в каждую лунку 48-луночного планшета. Поместите пластину вверх дном в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на один час, чтобы обеспечить полимеризацию ECM. После полимеризации добавьте в каждую лунку по 200 микролитров свежей питательной среды, а пустые наружные лунки заполните PBS.
Чтобы подготовить образец к визуализации, нанесите 15 микролитров органоидного купола ECM на чашку для визуализации с покровным стеклом номер 1,5 и инкубируйте его при комнатной температуре в течение одной минуты. Поместите тарелку вверх дном в инкубатор с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия на один час. Затем аккуратно добавьте достаточное количество питательной среды, чтобы полностью погрузить органоиды.
Через пять дней после пассажа промойте образец два-три раза PBS непосредственно перед визуализацией. Далее для визуализации включите контроллер окружающей среды. Блок контроллера камеры автоматически установит температуру на 37 градусов по Цельсию и углекислый газ на 5% Нажмите кнопку «Дверь», чтобы открыть дверь.
Добавьте воду, чтобы внутри камеры образовался тонкий слой. Поместите чашку для визуализации в держатель сосуда, вставьте ее в камеру визуализации и закрепите ее с помощью штифта, чтобы предотвратить движение. Закройте дверцу, чтобы предотвратить внешние световые помехи.
Теперь запустите программу TomoStudio X и войдите в систему. Нажмите кнопку Пуск, чтобы открыть главное окно, а затем нажмите кнопку Добавить проект в верхнем левом углу и назначьте эксперимент. Убедитесь, что выбран правильный тип среды для правильного использования показателя преломления.
Нажмите на нужный колодец на панели, а затем нажмите кнопку «Создать» вверху, чтобы зарегистрировать колодец в качестве образца. Затем нажмите «Настройка ROI» в правом верхнем углу, чтобы определить область интереса в блюде. После настройки нажмите «Запустить эксперимент» в правом нижнем углу, чтобы открыть окно «Получение изображений».
Нажмите кнопку «Загрузить судно» в углу, чтобы отобразить яркое изображение поля. Отрегулируйте положение Z с помощью кнопок Z и Z, чтобы сфокусировать изображение. На вкладке «Одно изображение» настройте размер ROI.
Захватывайте органоиды в поле зрения 160 микрометров на 160 микрометров и получайте стеки глубиной до 140 микрометров. Перейдите на вкладку «Интервальная съемка», чтобы настроить долгосрочную визуализацию и установить желаемую продолжительность и интервал времени. Щелкните значок Сканировать, чтобы зафиксировать текущее местоположение ROI.
Нажмите кнопку BF, чтобы настроить значения интенсивности и экспозиции для получения изображений в светлом поле. Переместите поле ROI на панели Предварительный просмотр, чтобы выбрать ROI. После выбора желаемого ROI нажмите «Добавить точку» внизу, и список точек визуализации будет создан.
Теперь нажмите «Получить», чтобы начать создание изображений и получить необработанные данные изображения. Запустите сервер обработки HTX, щелкнув значок рабочего стола. Перетащите файлы необработанных изображений на сервер обработки HTX.
Нажмите кнопку «Обработать», чтобы создать файл TCF из файла необработанного изображения. Запустите средство просмотра TomoAnalysis, щелкнув значок рабочего стола. Загрузите обработанные файлы TCF, перетащив их в окно просмотрщика.
Дважды щелкните миниатюру файла, чтобы открыть томограмму ROI. Изучайте 2D-вид, перемещаясь по плоскостям X, Y, Z с помощью элементов управления масштабированием, панорамированием и прокруткой. Щелкните значок вида визуализации MIP слева, чтобы переключиться в режим 3D-визуализации.
Перемещайтесь по 3D-виду, поворачивая, масштабируя и панорамируя изображение. Для сегментации изображений на основе машинного обучения экспортируйте файл изображения TCF в формат HDF5, чтобы убедиться, что данные представлены в многомерном формате, совместимом с ilastik. Откройте ilastik и перейдите в раздел «Новый проект».
Выберите «Классификация пикселей» в разделе «Рабочий процесс сегментации» и сохраните проект в указанной папке. Чтобы загрузить файл HGF5, перейдите на вкладку Входные данные, нажмите Добавить новый файл, выберите соответствующий набор данных H5 и проверьте правильное назначение каналов изображения. Теперь перейдите на вкладку Выбор объектов, чтобы выбрать такие характеристики, как цвет, интенсивность, края и текстура для оптимизации сегментации.
На вкладке «Тренировка» обозначьте органоидные и неорганоидные области мазками кисти разных цветов. Нажмите «Обновление в реальном времени», чтобы просмотреть результаты сегментации и при необходимости внести коррективы. После этого перейдите на вкладку «Экспорт прогнозов».
Выберите Простая сегментация в качестве источника для экспорта помеченных прогнозов и нажмите кнопку Экспортировать все. Установите формат экспорта H5 или TIFF в зависимости от требований анализа. Для количественного анализа откройте файл дополнительного кодирования 2.
Назначьте соответствующие пути к папкам для файла маски и соответствующего файла TCF в сценарии. Запустите код, чтобы начать количественный анализ. Код рассчитает объем органоидов, плотность белка и общее содержание белка для каждого набора данных.
На этом рисунке показана трехмерная реконструкция с высоким разрешением, используемая для визуализации общей морфологии органоидов тонкого кишечника. Визуализированные реконструкции показывают явные структурные различия между органоидами, обработанными транспортным средством и цисплатином, на всех трех глубинах оптического сечения. Органоиды, обработанные цисплатином, показали значительно больший объем, меньшую плотность белка и более высокое общее содержание белка по сравнению с органоидами, обработанными носителями, через 10 минут после обработки, что указывает на раннее структурное набухание и изменение белкового состава.
Покадровая визуализация в течение 24 часов показала, что органоиды, обработанные носителем, сохраняют структурную целостность, в то время как органоиды, обработанные цисплатином, испытывают прогрессирующую структурную деградацию, включая коллапс крипты и повышенную диссоциацию клеток, что предполагает зависимое от времени цитотоксическое повреждение. Количественное отслеживание подтвердило, что органоиды, обработанные носителями, увеличивались в объеме и содержании белка с течением времени, в то время как органоиды, обработанные цисплатином, показали зависимое от времени снижение обоих параметров, что указывает на то, что цисплатин подавляет рост и индуцирует клеточную деградацию. Плотность белка оставалась стабильной в органоидах, обработанных носителями, но постепенно снижалась в органоидах, обработанных цисплатином, в течение 24-часового периода, что свидетельствует о разрушении клеточной структуры и увеличении внеклеточного пространства из-за отшелушивания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол трехмерной визуализации органоидов с высоким разрешением без использования меток, что позволяет в режиме реального времени наблюдать структурную динамику и ответ на воздействие лекарственных препаратов. В данном подходе используется низкокогерентная голотомография, которая расширяет возможности мониторинга биофизических изменений в процессе развития органоидов.
Основные компоненты исследования
Область исследований
- Биология органоидов
- Методы биомедицинской визуализации
- Анализ ответа на лекарственные препараты
Теоретическая справка
- Значимость неинвазивной визуализации живых органоидов
- Использование ИИ для количественного подбора текстур
- Актуальность в моделировании заболеваний и прецизионной медицине
Используемые методы
- Голотомография для визуализации органоидов
- Культуры живых органоидов
- Количественный анализ данных визуализации на основе ИИ
Основные результаты
- Успешная визуализация органоидных структур в режиме реального времени
- Возможность неинвазивной оценки ответа на лекарственные препараты
- Демонстрация интеграции с компьютерным анализом для получения более глубоких данных
Выводы
- Данный метод демонстрирует новый подход к получению изображений органоидов с высоким разрешением.
- Он позволяет получить важные сведения о биофизических свойствах и эффектах лекарственных препаратов в живом биологическом контексте.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Безметочная 3D-визуализация кишечных органоидов с высоким разрешением с помощью низкокогерентной голотомографии позволяет проводить количественную оценку морфологии органоидов и их ответа на лекарственные препараты в режиме реального времени без фототоксичности или воздействия на образец. Интеграция с сегментацией на основе машинного обучения обеспечивает масштабируемый и объективный анализ жизнеспособности и структурных изменений, что повышает прогностическую достоверность на этапах первичного поиска и доклинических исследований. Данный рабочий процесс улучшает трансляционную преемственность и снижает риски при механистической оценке в рамках моделирования заболеваний на базе органоидов и фармацевтического скрининга.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает неинвазивный количественный анализ роста и жизнеспособности органоидов в экспериментальных условиях.
- Способствует снижению механистических рисков за счет отслеживания морфологических и биофизических изменений в режиме реального времени в ответ на воздействие исследуемых соединений.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней посредством объективного бесконтрастного мониторинга структуры органоидов и содержания белков.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые результаты визуализации для высокопроизводительного скрининга соединений в органоидных системах.
- Предоставляет количественные показатели, такие как объем, плотность и содержание белков, для поддержки разработки и оптимизации анализа.
- Обеспечивает масштабируемую сегментацию на основе машинного обучения для согласованного извлечения признаков из больших наборов данных.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям органоидов, релевантным конкретным заболеваниям, для поиска трансляционных биомаркеров и профилирования ответа на лекарственные препараты.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации, позволяя осуществлять лонгитюдный мониторинг реакций органоидов в режиме реального времени.
- Снижает биологическую неопределенность при принятии решений на доклиническом этапе, предоставляя количественные данные о цитотоксичности и структурной целостности с временным разрешением.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод связывает этапы раннего поиска, скрининга и доклинических исследований, предоставляя единую платформу для безмаркерной визуализации и анализа в исследованиях на основе органоидов.
- Открытия в биологии: Количественная визуализация в режиме реального времени позволяет проверять гипотезы и уточнять механизмы сигнальных путей в моделях органоидов.
- Скрининг: Сегментация с помощью машинного обучения и количественные выходные данные обеспечивают воспроизводимые рабочие процессы высокопроизводительного скрининга.
- Аналитика: Предоставляет данные об объеме, плотности белков и содержании компонентов для надежного сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Облегчает приведение в соответствие с моделями заболеваний и поддерживает оценку эффектов лекарственных средств на основе биомаркеров.
- Корпоративное использование: Адаптируемость к различным системам органоидов поддерживает широкое внедрение и стандартизацию в рамках всего портфеля исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в анализах на основе органоидов.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы визуализации и анализа.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективность использования капитала за счет ранней количественной оценки эффектов препаратов.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию и продвижение кандидатов с учетом рисков на основе надежных, трансляционно значимых данных.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами органоидов, передовыми методами визуализации и сегментацией на основе машинного обучения.
- Необходим доступ к оборудованию для голотомографии с низкой когерентностью и инфраструктуре для компьютерного анализа.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и конвейеров анализа данных.
- Метод адаптивен к различным системам органоидов, но может потребовать оптимизации для конкретных типов тканей или конечных точек эксперимента.
- Эффективность зависит от надежного управления данными и интеграции с последующим анализом для высокопроизводительных исследований.
