Многоуровневая микродиссекция и функционально-структурное профилирование ветвей почечных артерий человека

Наше исследование направлено на создание стандартизированных методов изоляции и функциональной оценки почечных артериальных ветвей человека, раскрытие механизмов сосудистой дисфункции и руководство таргетной терапией. Предыдущие исследования основывались на животных моделях или непрямой визуализации, где наша проволочная миография напрямую отражает функцию почечной артерии человека in vitro. Наш метод позволяет проводить точный, специфичный для человека сосудистый анализ, преодолевая видовые ограничения и улучшая трансляционную разработку лекарств.

Для начала убедитесь, что почечная ткань остается полностью погруженной в жидкость во время транспортировки, чтобы сохранить жизнеспособность ткани и структурную целостность. Визуально определите корональную плоскость, определив расположение ворот почки и выровняв разрез так, чтобы он проходил как через почечную лоханку, так и через латеральную выпуклую границу. Используя стерильный скальпель, рассеките почку вдоль этой корональной плоскости, чтобы создать две симметричные половины, и обнажите внутренние структуры, такие как почечные пирамиды и колонны.

Под стереомикроскопом с помощью микродиссекционных ножниц и щипцов тщательно разделите междолевые, дугообразные и междольковые артерии в 10-сантиметровой чашке для культуры с черным дном. Затем аккуратно удалите все окружающие ткани и жир из рассеченных артерий в той же 10-сантиметровой чашке для культуры с черным дном, чтобы тщательно очистить их. С помощью ножниц для микродиссекции рассекайте очищенные артерии на кольца длиной около двух миллиметров для исследования функции сосудов.

Осторожно вставьте первый направляющий провод в артериальное кольцо в чашке. Согните одну сторону направляющего провода под углом 90 градусов, и перенесите артериальное кольцо вместе с проводом в камеру. Перед фиксацией артериального кольца на держателе образца запишите длину сосуда.

Поместите кольцо между двумя держателями и считайте показания микрометровой шкалы, где одно деление шкалы равно 10 микрометрам. Вычтите начальное значение шкалы, измеренное, когда держатели просто соприкасаются друг с другом, чтобы рассчитать длину и ширину артериального кольца. Затем закрепите артериальное кольцо на держателе образца типа «моллюск» с помощью прилагаемых прибором винтов, затянув их по часовой стрелке.

Затем проденьте второй направляющий провод через артериальное кольцо. Намотайте проволоку по часовой стрелке на крепежные винты с обоих концов, плотно закрепив ее на поверхности держателя образца. Выберите «Настройки нормализации» в меню DMT и установите калибровку окуляра как один миллиметр на деление, целевое давление как 13,3 килопаскаля, IC1/IC100 как 0,9, время усреднения по сети как три секунды и время задержки как 60 секунд.

Выберите канал, соответствующий целевой артерии, и откройте экран «Нормализация» в меню DMT. В соответствующих полях введите конечные точки ткани, так как a1 равно нулю, а a2 равно измеренной длине сосуда в миллиметрах. Введите диаметр провода 40 микрометров и введите показания микрометра со шкалы.

Нажмите кнопку Добавить точку, чтобы сохранить данные. Теперь примените пассивную растяжку и подождите три минуты. Введите новое показание микрометра в качестве следующей точки и нажмите кнопку Добавить точку.

Добавьте в камеру пять миллилитров 60 раствора ионов калия, чтобы вызвать опосредованное калием сокращение сосуда. Чтобы вымыть 60 раствор иона калия, добавьте пять миллилитров раствора Кребса в три раза. Чтобы оценить индуцированное фенилэфрином, зависящее от концентрации сокращение, применяйте кумулятивный фенилэфрин с шагом в половину логарифма от 10 в степени отрицательных девяти до 10 в степени отрицательных четырех моляров.

Для дополнительной проверки на наркотики промойте камеру теплыми пятью миллилитрами раствора Кребса не менее пяти раз, пока напряжение не вернется к исходному уровню и не останется стабильным в течение не менее 10 минут. Междолевая артерия была успешно отделена от мозгового вещества почки, при этом была обнаружена толстая сосудистая стенка и окружающая жировая ткань, которая потребовала тщательного удаления для сохранения структурной целостности. Дугообразная артерия была изолирована в кортикомедуллярном соединении, демонстрируя более тонкую сосудистую стенку и изогнутую траекторию.

Была идентифицирована междольковая артерия, проходящая линейно через почечную кору с очень тонкой стенкой и плотно интегрированная с кортикальной тканью. Гистологический анализ показал, что междолевая артерия имеет самую толстую сосудистую стенку с выраженной адвентицией, в то время как дугообразные и междольковые артерии имеют все более тонкие стенки и меньшее количество гладких мышечных слоев. Артериальная нормализация включала повторное механическое растяжение и калий-индуцированную стимуляцию, устанавливая стабильные исходные условия напряжения между образцами.

Кумулятивное присоединение фенилэфрина от 10 в степени отрицательных девяти до 10 в степени отрицательных четырех молярных концентраций индуцировало все более сильные сокращения в артериальных кольцах дозозависимым образом. В предсокращенных артериях фенилэфрина увеличение концентраций ацетилхолина с 10 до степени отрицательных восьми до трех умножить на 10 до отрицательной концентрации пяти моляров приводило к зависимой от концентрации вазодилатации.