Анализ нефрона Состав и функции в почках взрослых данио рерио

Общей целью данного эксперимента является оценка состава и функциональности сегмента нефрона в почках взрослой рыбы данио. Это достигается путем введения флуоресцентно меченного декстрина в гнездо, которое связывает рыб данио. Вторым этапом является удаление и фиксация почки для подготовки тканей к последующим методам мечения.

Затем почка отбеливается для удаления пигментации, а затем окрашивается до флуоресцентной маркировки нужных сегментов нефрона. Результаты получают с помощью иммунофлюоресценции, микроскопии и/или визуализации в светлом поле, которые позволяют визуализировать анатомию почки на основе выбранного окрашивания или красителей. Следующие методы мечения могут помочь ответить на ключевые вопросы в области почек, касающиеся анатомии органов, и могут быть использованы для изучения состава нефрона и оценки функциональности почек как до, так и после травмы.

Применение этих методов распространяется на изучение генетических аномалий в формировании почек у взрослых, а также может быть применено для оценки почечного статуса при моделировании хронических заболеваний. Для начала сцедите раствор из обезболенной рыбы и осторожно положите животное на влажную губку формовочной брюшной стороны. Затем наполните инсулиновый шприц 20 микролитрами размороженного стокового раствора декстрина.

Расположите иглу так, чтобы введение происходило под небольшим углом у вентральной средней линии живота. Чтобы избежать незначительной инъекции органов, поднимите иглу сразу после инъекции, чтобы приподнять стенку тела и создать пространство для введения раствора. После инъекции аккуратно верните рыбок в аквариум для восстановления от наркоза.

Для начала сцедите лишний раствор из обезболиваемой рыбы и положите его на салфетку или бумажное полотенце. После удаления головы и внутренних органов используйте сверхтонкие иглы для препарирования, чтобы вскрыть стенки тела. Найдите почечный орган, который прилегает к дорсальной стенке животного.

Используйте тонкие щипцы, чтобы отделить почку от дорсальной стенки. Аккуратно поместите почку в стеклянный флакон объемом пять миллилитров, содержащий один XPBS, и промойте три раза по пять минут каждый. Извлеките почку с помощью переводной пипетки и поместите ее на предметное стекло с одной-двумя каплями одной XPBS.

Используйте тонкие щипцы, чтобы сплющить почку на предметном стекле, убедившись, что ни одна ткань не скрутилась или иным образом не перевернулась. Инструмент из вольфрамовой проволоки может быть использован для выполнения небольших разрезов в соединительной ткани, чтобы облегчить плоское положение почки. Затем положите небольшие кусочки пластилина на каждый угол стеклянной крышки размером 18 на 18 миллиметров.

Медленно установите крышку листа на почку, сохраняя небольшой угол. Чтобы свести к минимуму улавливание пузырьков воздуха, при необходимости добавьте еще одну каплю XPBS, чтобы заполнить пространство между защитным стеклом и слайдом. Отдельную группу рыбок данио усыпляют и замачивают в фиксаторе на ночь.

Когда все будет готово, с помощью тонких щипцов осторожно отделите почку от дорсальной стенки тела и поместите орган в стеклянный флакон. Промойте рассеченную почку три раза тремя-пятью миллилитрами одного XPBS с 0,05% подростка в течение пяти минут каждый. Далее удалите раствор PBS и промойте почку тремя миллилитрами 5%-ного раствора сахарозы в течение 30 минут.

По истечении этого времени замените раствор тремя миллилитрами 30% сахарозы и храните на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день. Удалите раствор и промойте почку два раза, прежде чем добавить от трех до пяти миллилитров отбеливающего раствора. Чтобы удалить пигментацию меланоцитов, присутствующую на почечном органе, поместите стеклянный флакон на вращатель и внимательно наблюдайте, как пигментация исчезает.

Депигментация обычно занимает около 20 минут, но иногда может занимать до 60 минут. Если оставить отбеливающий раствор слишком долго, может произойти распад, поэтому рекомендуется контролировать образец каждые 10-15 минут, чтобы проверить целостность после того, как пигментация была удалена из промывки почек дважды, и инкубировать с 4% раствором PFA в течение одного часа при комнатной температуре. Далее удалите 4%-ный раствор PFA и промойте почку три раза после последнего промывания на трех-пяти миллилитрах блокирующего раствора и инкубируйте почку при комнатной температуре в течение двух часов.

Когда блокировка будет завершена, перейдите непосредственно к выбранному протоколу окрашивания. Удалите блокирующий раствор и промойте почку три раза, прежде чем дать почки впитаться в одном XPBS не менее чем на 10 минут. За это время переложите почку в чашку для посева на 12 лунок или на 24 лунки.

Замените один XPBS достаточным количеством рабочего раствора щелочной фосфатазы, чтобы покрыть образец, и поместите образец на вращатель на 30 минут при комнатной температуре. По истечении этого времени остановите реакцию, промыв почку в щелочном фосфатазном буферном растворе. Промойте почку с помощью трех замен промывочного буферного раствора в течение 10-15 минут.

Затем удалите буферный раствор для промывки и установите почку на чистый стакан. Вставьте монтажную среду фосфатазы, входящую в комплект для маркировки. Визуализируйте окрашенную щелочной фосфатазой почку с помощью стереомикроскопа или составного микроскопа с подключенным к Дебби фильтром.

Сначала приготовьте рабочий раствор DBA объемом 200 микролитров, разбавив DBA в одном XPBS. Замените раствор PBS 200 микролитрами раствора DBA и поместите образец на вращатель на один час при комнатной температуре. По истечении этого времени удалите раствор DBA и трижды промойте почку тремя-пятью миллилитрами одного XPBS в течение пяти минут каждый.

Снимите один XPBS и установите почку на чистое предметное стекло. Как было показано ранее, визуализируйте окрашенные DBA дистальные сегменты почки с помощью стандартного фильтра Trixie или Texas red, установленного на флуоресцентном стереомикроскопе или составном микроскопе. На этом светлопольном изображении необеленной почки черная пигментация соответствует разбросанной популяции меланоцитов.

Здесь сегменты нефрон ПКТ визуализируются через три дня после инъекции декстрина. Вкладыш содержит изображение одного нефрона с меланоцитами. На этом снимке показана взрослая почка после удаления пигментации меланоцитов.

Эти репрезентативные изображения демонстрируют небольшие морфологические различия между сегментами ПЦТ, в то время как многие нефронные ПКТ плотно скручены. Другие нефроны содержат участки ПКТ, которые имеют минимальную катушку: декстрин каскадный синий декстрин, желтый Люцифер и флюорографический декстрин Руби все они преимущественно маркируют сегменты ПКТ в почечных нефронах, оба декстрина Cascade Blue и Люцифер Желтый демонстрируют некоторую неспецифическую мечение с гораздо более высоким фоном, наблюдаемым в почках, обработанных Люцифером желтым. Напротив, декстрин фтор руби показал значительно сниженный фон при интенсивном мечении ПКТ.

Взрослая почка, окрашенная желанием обнаружить специфический маркер типа клеток-транспортеров ПЦТ, демонстрирует характерный для поглощения декстрина паттерн экспрессии с распределением различных плотно закрученных петлевых доменов ПЦТ, а также более удлиненных участков ПКТ, которые демонстрируют постоянный широкий диаметр. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как успешно маркировать сегменты нефрона в почке взрослой рыбки данио, такие как проксимальный каналец щелочной фосфатазой и дистальный каналец медика с помощью DBA. Не забывайте, что работа с 4% паральдегидом может быть чрезвычайно опасной, и во время выполнения этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение пальто, перчаток и очков.