3D Flipwell Engineering для разработки асинхронных систем токсикологической и иммуномодулирующей терапии бактериальных, кишечных и иммунных клеток

Мы разработали 3D-систему ко-культуры, имитирующую слизистое окружение кишечника, чтобы изучать серийные перекрёстные контакты и оценивать ответы на лекарства, которые могут использоваться для скрининга препаратов и понимания слизистоковых клеточных взаимодействий. Разные группы разработали несколько различных систем культуры для моделирования слизистой среды кишечника с использованием очень сложных биоинженерных методов. Но вместо этого мы разработали систему совместной культуры, которую гораздо проще производить из более дешёвых материалов.

Наша кокультурная система показала, что протеиногенный препарат запускает скоординированные реакции между кишечными бактериями, эпителиальными и иммунными клетками, активируя иммунитет хозяина, вероятно, вместе с нашими бактериальными метаболитами, и обеспечивая межвидовую коммуникацию. Наша цель — изучать как аэробные, так и анеробные бактериальные штаммы и их метаболиты, чтобы выявить иммуномодулирующие эффекты, прокладывая путь для новых иммунотерапевтических стратегий на основе бактериальных метаболитов. Для начала откройте крышку чашки Петри и отложите её в сторону.

Положите лезвие скальпеля на край дна чашки Петри. Возьмите стерильный пинцет и аккуратно поднимите вставку снизу вверх, чтобы вынуть её из упаковки. Другой рукой возьмите стерильное лезвие скальпеля и поднимите его к вставке.

Движением в форме буквы С проколите мембрану по краю и аккуратно скользите лезвием скальпеля по нижней части вставки, оставаясь близко к пластиковой стенке. Вырежьте ПЭТ-мембрану и используйте второй комплект пинцета, чтобы её удалить. Затем используйте лезвие скальпеля, чтобы соскрести белые стружки мембраны и очистить край и край вставки.

Затем аккуратно распределите 2-3 миллиметровую шарик силикона по всему дну вставки, стараясь не касаться мембраны. Возьмите второй комплект стерильных щипцев и аккуратно поднимите первую вставку, не вытаскивая мембрану из защитного пакета. Соедините две вставки снизу вниз, чтобы нижние обода совпали.

Когда стопка Flipwell будет склеена, положите её в оригинальный стерильный пакет или в глубокую чашку Петри, чтобы она высохла 72 часа. Используйте крышку от указанных чашек Петри, чтобы накрыть стек. Чтобы стерилизовать сборки стека, используйте стерильные щипцы, чтобы подвесить стопку Flipwell на край указанного глубокого обода чашки Петри.

Затем закройте стеклянную раму шкафа с биобезопасностью и включите ультрафиолетовый свет. Чтобы проверить утечку перед нанесением коллагенового покрытия, сначала добавьте 500 микролитров стерильной PBS или стерильной деионизированной воды. На следующий день аспирируйте жидкость, используемую для тестирования, перед сушкой труб в течение 1-2 часов внутри шкафа для биобезопасности.

Чтобы покрыть мембрану коллагеном, откройте крышку чашки Петри и пусть Flipwell повисает на краю чашки Петри. Аккуратно добавьте 200 микролитров раствора коллагена к одной стороне стека вставок. Аспирируйте раствор коллагена через час, затем пипетьте 200 микролитров стерильного PBS. После аспирации PBS накройте чашку Петри крышкой и дайте мембране высохнуть 60 минут внутри шкафа.

Когда мембрана высохнет, используйте стерильные щипцы или пинцет, переверните Flipwell на противоположную сторону и дайте ему свисать на краю чашки Петри. Чтобы сделать бактериальную вставку, поместите два комплекта стерильных щипцев и 24-гнездовые вставки внутри шкафа для биобезопасности. Стерильным пинцетом поднимите вставку из стерильного пакета.

Со вторым набором пинцета или щипцов отломите маленькие пластиковые ножки внизу вставки. Протестируйте 24-колодную вставку, поместив её в один из стерильных кокультурных стеков Flipwell или оригинальные 12-ядровые вставки. Чтобы начать засев Флипвеллов, засейте по 500 микролитров линий эпителиальных клеток с каждой стороны апикальной стороны Флипвелла.

Накройте сборки крышкой чашки Петри, затем инкубируйте при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа на ночь, пока клетки не присоединятся. Откройте крышку чашки Петри и втяните DMEM-носитель с апикальной стороны стека Flipwell. С помощью стерильных щипцов аккуратно возьмите Flipwell за крючок и поверните его на 180 градусов.

Со второй комплектом стерильных щипцов возьмите стопку Flipwell за другой крючок, теперь обращённый вверх. Затем опустите сборку обратно в чашку Петри и повесите крючок на край чашки Петри. Добавьте 500 микролитров суспензии ячейки THP-1 на апикальную сторону ко-культурной вставной трубки.

Скорректируйте среду HT-29 для эпителиальных клеток толстой кишки, добавив среду в глубокую чашку Петри. Чтобы убрать воздушные пузырьки, держите стек Flipwell за руку стерильными щипцами. Аккуратно опустите иглу вставка и под вставку и очень аккуратно поднимите мягкий наконечник к пузырьку воздуха.

Осторожно и очень медленно подтяните поршень шприца и наблюдайте, как пузырь воздуха медленно исчезает. Затем аккуратно выньте иглу и шприц из Flipwell. После удаления воздушных пузырьков с помощью игли, оба типа клеток культивируются в инкубаторе клеточной культуры.

Щипцом вставьте вставку в стерильную чашку Петри и накройте крышкой. Переложите чашку Петри с Flipwell в шкаф с биобезопасностью и отложите с противоположной стороны чаши с бактериальными вставками. Вытащите 300 микролитров медиа DMEM с апикальной стороны Flipwell для бактериальной вставки, затем накройте крышкой чашки Петри.

Теперь добавьте 50–100 микролитров культуры Bacillus subtilis в бактериальные вставки на 24 лунки и вставьте их в верхнюю часть Flipwell. Поверните рычаг и подвесьте его на край стопки вставок Flipwell Co-Cultural Stack. Держите стопку вторым набором стерильных щипцов.

После трёхчасовой инкубации используйте стерильные щипцы, чтобы удалить бактериальную вставку из Flipwell. Поместите Flipwell в коническую трубку объёмом 50 миллилитров без разборки. Чтобы разобрать Flipwell для электронной микроскопии, держите его обеими руками и скручивайте каждую склеенную часть стека.

Поверните вставку вместе с мембраной и поставьте её так, чтобы мембрана была направлена вверх. Держите вставку, аккуратно вырезайте мембрану лезвием скальпеля, затем поместите её в 1,7-миллилитровую трубку с раствором параформного альдегида. Для конфокальной микроскопии добавьте 300 микролитров стерильной PBS на апикальную сторону.

Аккуратно снимите стопку из чашки Петри после того, как вытащите PBS пипкой. Теперь переверните Flipwell и добавьте 300 микролитров PBS к теперь направленной вверх стороной стека вставок Flipwell Co-культуры, затем аспирируйте фосфатно-буферный физиологический раствор. Используя пипетку объемом 200 микролитров, создайте большую каплю PBS.

Открутите вставку, чтобы разделить его на вставки. Затем аккуратно разместите стек Flipwell с элементами THP-1 поверх 200-микролитрового дропа PBS. Добавьте 200 микролитров буфера для проницаемости на верхнюю сторону с эпителиальными клетками толстой кишки и оставьте на 10 минут.

Для иммунофлуоресцентного окрашивания наносите 300 микролитров первичного антитела в верхнюю часть вставки. Добавьте 300 микролитров первичного антитела в 12-лунную пластину, затем поместите вставку внутри ямы поверх капли. Хорошо закройте антитела.

Окрашивание показало резкое увеличение секреции слизи в эпителиальном компартменте кишечника после обработки сепиаптерином, что подтверждается увеличением уровня белка эпителиального маркера CK20 и слизистого белка MUC2. В монокультурах THP-1 лечение сепиаптерином значительно увеличило экспрессию маркера макрофагов M1 CD80, одновременно снижая модуляцию маркера M2 макрофагов CD163, что указывает на поляризацию M1. Сканирующая электронная микроскопия выявила повышенную секрецию слизи из эпителиальных клеток в кокультурах, обработанных СЕП.

Морфология макрофагов, индуцированная лечением сепиаптерином, напоминающая фенотип M1 как в монокультурах, так и в кокультурах. Бактериальные клетки в монокультурах, обработанных сепиаптерином, имели морщинистые поверхности, характерные для формирования биопленки.