Трехмерная визуализация опухолевой ткани с использованием итерационного отбеливания расширяет подход мультиплексности

Это исследование направлено на определение мишеней для иммуномодулирующих препаратов и сложных солидных опухолей желудочно-кишечного тракта. Анализ микроокружения опухоли, клеточного ландшафта абсолютно необходим для понимания восприимчивости к таким методам лечения, как иммунотерапия. Секвенирование одиночных клеток и проточная цитометрия помогают охарактеризовать микроокружение опухоли, но им не хватает пространственного контекста. В последнее время появились мультиплексная визуализация и транскриптомные платформы для изучения микроокружения опухоли в его контексте in-vivo.

Доступные мультиплексные технологии для анализа микроокружения опухоли, будь то итеративные или все в одном, ограничены двумя измерениями. Этот протокол расширяет характеристики до глубинного измерения, предоставляя информацию за пределами отдельных FFPE или замороженных сечений.

[Рассказчик] Для начала переложите листы салфетки в чашку для образцов с теплой средой для сбора урожая и поместите ее на нагревательную тарелку на столе для подготовки. Закрепите ткань на платформах в 15-сантиметровой пластине, содержащей среду для сбора урожая. Осторожно накиньте опухолевую ткань мезотелиальной стороной вверх на сторону маленького отверстия платформы и закрепите ее шелковым швом 2-0. Поместите подготовленную тканевую платформу, обратно полностью погруженную в 24-луночный планшет, содержащий среду для сбора урожая. Для фиксации добавьте 10 миллилитров фиксирующего материала в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 30 миллилитров холодного PBS, чтобы приготовить 40 миллилитров фиксирующего буфера. С помощью щипцов перенесите ткань, установленную на платформах, в фиксирующий буфер. И инкубировать в течение 24 часов при температуре 4 градуса Цельсия. Сцедите фиксатор. Замените его на 40 миллилитров холодного PBS. И выдерживать 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Для окрашивания добавьте в лунку 1 миллилитр блокирующего буфера и вставьте тканевую платформу. Заблокируйте не менее чем на два часа при комнатной температуре на коромысле, установленном на низкую скорость 30 об/мин. Приготовьте 0,8 мл раствора красителя антител в микроцентрифужной пробирке и центрифугируйте при 10 000 г в течение двух минут при комнатной температуре. Перелейте 0,75 миллитра надосадочной жидкости в чистую лунку 9-луночной инкубационной тарелки. И вставляем вымытую платформу. Оберните тарелку алюминиевой фольгой. И инкубировать не менее двух часов при комнатной температуре на коромысле, выставленном на низкую скорость 30 об/мин. Промойте платформу в 50-миллилитровой конической трубке, содержащей 40 миллилитров PBS, в течение 10 минут при температуре 4 градуса Цельсия. Добавьте 0,1 миллилитра PBS в центр стеклянного дна 3,5-сантиметровой чашки для визуализации и отложите его в сторону. Свободно вкрутите кольцо регулировки высоты по часовой стрелке в наружную крышку. И установите платформу во внутренний пластиковый держатель, обеспечив выравнивание пазов выемки. Закрепите платформу с помощью слайдера. Поместите собранный адаптер изображения на стеклянную нижнюю чашку и осторожно опустите кольцо регулировки высоты до тех пор, пока ткань не коснется буфера. Как только будет достигнуто оптимальное расстояние от стекла, добавьте 0,2 миллилитра PBS на ткань нижней стороной вверх, чтобы предотвратить обезвоживание тканей во время визуализации. Запустите программное обеспечение для получения изображений. Выберите подходящий объектив, например 20X или 40X, и добавьте соответствующую среду погружения. Выберите параметры получения изображений, такие как скорость сканирования 600 герц, разрешение XY 1024 на 1024 пикселя, трехстрочные средние значения и двунаправленное сканирование. Выберите подходящие лазерные линии или настройте лазер белого света в соответствии со спектрами возбуждения и излучения флуорофоров, используемых для окрашивания. Поместите собранную чашку для визуализации в держатель для образцов на предметном столике микроскопа. Центрируйте образец с помощью элемента управления XY, поднесите объектив к защитному стеклу и начните получение изображения. После каждого раунда визуализации выполняйте этап отбеливания. Приготовьте 5 миллилитров 1,5 миллиграмм на миллилитр раствора боргидрида лития в дистиллированной воде, и выдержите в течение 30 минут при комнатной температуре. Перелейте 1 миллилитр раствора боргидрида лития в чистую лунку 9-луночной инкубационной пластины и вставьте промытую платформу на 60 минут при комнатной температуре. Кратковременно промойте платформу в 20 миллилитрах PBS внутри конической трубки. Проверьте наличие оставшегося флуоресцентного сигнала с помощью максимальной настройки лазера для компенсации Z. Здесь показан образец брюшины, несущий опухоль, окрашенный с помощью первого раунда итерационного отбеливания, расширяющий мультиплексность, или IBEX 1, панель для визуализации. Опухолевые поражения были идентифицированы как розеткообразные структуры, которые были дважды положительными на CD44 и подопланин с ядерными расположениями, характерными для папиллярной мезотелиомы. Здесь представлены иммунофлуоресцентные изображения с высоким разрешением выбранных областей из образца брюшины, несущего опухоль. Эти изображения выявляют опухолевые области и границы третичной лимфоидной структуры опухоли, подчеркивая последовательную инфильтрацию иммунных клеток с высокой плотностью CD45-положительных клеток. На этом рисунке представлено итеративное иммунофлуоресцентное окрашивание в циклах IBEX с первого по шестой, иллюстрирующее пространственное распределение иммунных и структурных маркеров в пределах границы раздела поражения опухоли и третичной лимфоидной структуры опухоли. Здесь представлены максимальные проекции различных оптических сечений. Эта 3D-визуализация подтвердила, что опухолевые поражения и третичные лимфоидные структуры находятся на разной глубине Z, демонстрируя ограничения 2D-визуализации в захвате сложной архитектуры тканей.