Микрофлюидный чип для построения моделей аксональных травм и обеспечения мультиомиксного анализа

Мы разработали крупномасштабные микрофлюидные чипы для проведения мультиомического анализа с целью иллюстрации метаболического механизма нейронов после повреждения аксонов. В основном мы используем микрофлюидные технологии, анализ метаболических потоков и транскриптомику для продвижения исследований метаболических механизмов нейронов во время повреждения и регенерации аксонов. Мы обнаружили, что существуют метаболические различия между нейронами коры головного мозга при различных заболеваниях развития, и что молодые нейроны подвергаются метаболическому ремоделированию после внешнего повреждения.

Основное преимущество нашего протокола заключается в более масштабной конструкции микрофлюидной платформы и эксплуатационных стандартах, которые обеспечивают точную мультиомику и размер миллионов ячеек. Для начала переложите основу PDMS и отвердитель в центрифужную пробирку. Поместите центрифужную трубку со смесью в центробежную мешалку.

Центрифугируйте при 2000 G в течение четырех минут дважды для смешивания и дегазации. Залейте от 13 до 15 граммов дегазированного PDMS в микрофлюидную форму, убедившись, что дно формы полностью закрыто. Теперь поместите форму в вакуумный эксикатор, затем используйте вакуумный насос для откачки воздуха в течение пяти-10 минут, чтобы тщательно удалить пузырьки из PDMS.

С помощью резиновой груши осторожно постучите по поверхности PDMS, чтобы разбить оставшиеся пузырьки на поверхности. Перенесите форму в конвекционную печь и выпекайте при температуре 80 градусов Цельсия в течение 100 минут, чтобы полидиметилсилоксан затвердел. Как только PDMS полностью затвердеет, осторожно проведите кончиком скальпеля под край PDMS, чтобы осторожно поднять и отделить его от формы.

С помощью биопсийного перфоратора диаметром от 2,0 до 2,5 миллиметров создать отверстия в ПДМС для инфузии питательной среды и загрузки клеток. Удалите все поверхностные загрязнения с PDMS с помощью клейкой ленты, затем поместите ее в чистую стеклянную посуду и оберните алюминиевой фольгой для хранения. Перед началом эксперимента в автоклаве микрофлюидное устройство при температуре 121 градус Цельсия и 101 килопаскаль в течение пяти минут, чтобы обеспечить стерильность.

Поместите защитный листок, предназначенный для обычных микрофлюидных устройств, в 35-миллиметровую чашку для культивирования. Добавьте в блюдо два миллилитра по 0,1 миллиграмм на миллилитр раствора поли-D-лизина. Выдержите блюдо при температуре 37 градусов Цельсия в течение шести часов или на ночь.

После инкубации осторожно извлеките раствор поли-D-лизина для повторного использования или надлежащей утилизации. Теперь добавьте в блюдо два миллилитра стерильной сверхчистой воды. Поверните его 50 раз по часовой стрелке, а затем 50 раз против часовой стрелки.

Отсасывайте воду с помощью вакуумного насоса, подключенного к стерильному наконечнику для пипетки, собирая отходы в контейнер для жидких отходов. После завершения всех стирок дайте чехлом высохнуть на воздухе естественным образом в шкафу для биобезопасности перед использованием. С помощью стерильных щипцов с тонким наконечником поместите автоклавный микрофлюидный чип в центр стеклянной поверхности микроканалами вниз.

Аккуратно прижмите чип к стеклянной поверхности с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров, чтобы обеспечить полное сцепление. Далее отметьте левую камеру точкой с помощью перманентного маркера для обозначения отсека сомы. Аспирируйте 10 микролитров нейрональной суспензии с помощью пипетки объемом 10 микролитров, затем медленно дозируйте суспензию в загрузочное отверстие над отмеченным отсеком сомы.

Убедитесь в правильности поступления жидкости в нижний резервуар левой камеры. Перенесите чашку для культивирования во увлажненный инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 20 минут. После инкубации поместите чашку под 20-кратный микроскоп, чтобы подтвердить обильность среды из сома-компартмента в аксональный компартмент через микроканалы.

Теперь пипетка подает 150 микролитров нейрональной базальной среды в верхний порт аксонального компартмента. Аналогичным образом добавьте 150 микролитров полной нейронной среды в верхний порт сомового отсека. Далее в 150-миллиметровую чашку для культуры наливают 20 миллилитров сверхчистой воды для создания камеры влажности.

Поместите 35-миллиметровую чашку для культивирования внутрь большой чашки, затем перенесите всю систему культивирования в инкубатор и поддерживайте в течение необходимого времени. Используйте чашку Петри шириной 10 сантиметров для размещения крупномасштабного микрофлюидного устройства. Выбирайте затравку полного канала или интервального канала в зависимости от экспериментальных потребностей, так как для каждого метода требуются разные протоколы травмирования аксонов.

После того, как посев будет завершен, добавьте пять миллилитров полной питательной среды нейронов в чашку Петри, чтобы поддерживать рост нейронов. Перелейте соответствующее количество нейронной базальной среды в новую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров для последующего использования. Поместите микрофлюидное устройство, содержащее корковые нейроны, на чистую скамью.

Используя безворсовую бумагу, высушите дно 35-миллиметровой чашки для культур, затем с помощью пипетки объемом 200 микролитров отсасывайте среду из двух правых боковых отверстий микрофлюидного устройства. Затем подсоедините трубку вакуумного насоса к стерильному наконечнику для дозатора объемом 200 микролитров без фильтра. Включите вакуумный насос со скоростью всасывания 60 литров в минуту и направьте наконечник в точку соединения между нижним отверстием концевой камеры аксона и камерой для аспирации старой среды, что приведет к поломке аксона из-за отрицательного давления.

Замените наконечник пипетки и наберите 150 микролитров нейронной базальной среды, медленно добавляя ее через нижнее отверстие правой камеры. После выполнения присоединения и аспирации четыре раза, замените ее свежей полной нейронной средой, затем аспирируйте старую среду из бокового отверстия тела клетки и при необходимости добавьте свежую полную нейронную среду, содержащую лекарства. Поместите микрофлюидное устройство вместе с чашкой для культивирования в 150-миллиметровую чашку для культивирования и продолжайте культивирование в течение необходимого времени, например, 24 часа.

При мануальном повреждении аксонов засейте нейроны во все камеры крупномасштабного микрофлюидного устройства. Инкубируйте устройство при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение трех дней. На седьмой день in vitro извлеките из инкубатора чашку для культивирования, содержащую микрофлюидное устройство, и поместите ее на стерильную стадию.

Подготовьте микроскоп с 20-кратным увеличением и простерилизуйте рабочую зону, используя 75% этанол. Возьмите в руки стерильный наконечник пипетки объемом 10 микролитров и определите пучки аксонов в исходных микроканалах под руководством микроскопа. Выполните продольные царапины вдоль каждого пучка аксонов с помощью наконечника пипетки.

Наблюдайте за обрывом аксона под микроскопом в режиме реального времени. Микроканалы стандартного микрофлюидного устройства обеспечивают рост аксонов, но не сомы, что подтверждается окрашиванием бета-3 тубулином в течение семи дней in vitro. Плотность нейронов не показала существенной разницы после аксонального повреждения, что указывает на отсутствие наблюдаемой гибели нейронов.

Для мультиомного анализа было разработано крупномасштабное микрофлюидное устройство с трехмерной расширяемой конструкцией. Как неперфорированные, так и перфорированные реплики PDMS надежно приклеивались к 10-сантиметровым тарелкам или печатным платам. Повреждение аксонов, вызванное царапинами на кончике пипетки, приводило к четко разорванным аксонам с нарушенной морфологией, в отличие от неповрежденных аксонов до травмы.

Регенерация аксонов наблюдалась как через 6 часов, так и через 24 часа после травмы, в то время как неповрежденные аксоны оставались стабильными. Концентрация белка в нейронах значительно возросла с 1420,4 микрограмм на миллилитр на исходном уровне до 1748,9 микрограмм на миллилитр через шесть часов и 1823,7 микрограмм на миллилитр через 24 часа после травмы. Выходы РНК из контрольной и поврежденной групп аксонов были почти идентичны.

Секвенирование РНК выявило 595 генов, специфичных для травмы, и 609 контрольных генов, из которых 17 471 ген являются общими для разных групп. Анализ путей KEGG выявил значительное повышение регуляции окислительного фосфорилирования, реакции активных форм кислорода, аутофагии и циклических путей ТСА после травмы.