Клеточный подтип-специфичный анализ протеасомы нейрональной мембраны в соматосенсорных нейронах

Мы исследуем механизмы того, как соматосенсорные нейроны взаимодействуют через недавно обнаруженную нейронную мембрану протеасому или NNP, чтобы модулировать то, как мы ощущаем прикосновение, зуд и боль. Недавно мы обнаружили протеасому нейронной мембраны, специализированный комплекс для деградации белка, обнаруженный в некоторых сенсорных нейронах, который функционирует, модулируя чувствительность к прикосновению, зуду и боли. С помощью этого протокола мы сможем исследовать экспрессию и динамику модуляции NMP в зависимости от типа клеток в условиях здоровья и заболевания.

Наш протокол позволяет выделять нейроны, экспрессирующие NMP, от нейронов, экспрессирующих не NMP, чтобы иметь возможность изучать их функцию с учетом специфичности типа клеток. Важно отметить, что эти изолированные нейронные популяции остаются жизнеспособными для последующих анализов. С помощью этих протоколов мы начнем исследовать, как различные невропатические состояния влияют на экспрессию и функцию NMP, и как это способствует изменению прикосновения, зуда и болевых ощущений.

Для начала переложите собранные ганглии дорсального корня в коническую трубку объемом 15 миллилитров. С помощью пипетки добавьте в пробирку семь миллилитров рабочего раствора фермента диссоциации тканей и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия при слабом перемешивании в течение 20 минут. Поместите пробирку в центрифугу и вращайте ганглии при 120 G в течение двух минут.

Осторожно отсасывайте надосадочную жидкость, не нарушая гранулы. Ресуспендируйте ганглии в семи миллилитрах смеси фермента диссоциации тканей с низким содержанием растирания с папаином. После повторного центрифугирования пробирки аспирируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Затем повторно суспендируйте ганглии в 500 микролитрах раствора BSA, TI и DMEM. С помощью одномиллилитровой, закупоренной огнем отполированной стеклянной пипеткой, растирайте ганглии от 12 до 16 раз. Пропустите клеточную суспензию через клеточный фильтр 40 микрометров, чтобы отфильтровать клеточный мусор.

Промойте ситечко одним миллилитром раствора BSA, TI и DMEM, чтобы собрать оставшиеся нейроны ганглиев дорсальных корешков. Переложите отфильтрованную клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Подготовьте лоток для окрашивания иммунофлуоресцентным веществом, выстелив его большим куском парапленки.

С помощью стерильных щипцов 5-45 перенесите покровные стекла из чашки для культуры тканей на парапленку, следя за тем, чтобы сторона, содержащая нейроны ганглиев дорсального корня, была обращена вверх. Медленно нанесите пипеткой 100 микролитров среды ганглиев дорсального корня на каждую покровную пластинку, чтобы предотвратить высыхание клеток. Затем разведите первичное антитело go anti PSM альфа два в теплой среде ганглиев дорсальных корешков до получения разведения от одного до 20.

С помощью аспиратора с нефильтрованным наконечником P10 медленно удалите фильтрующий материал с края каждого защитного накладки. Добавьте 100 микролитров раствора антител go anti PSM alpha two в каждую крышку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 40 минут. После этого тщательно отсасывайте первичный раствор антитела из каждого покровного промахивателя.

Добавьте в клетки 100 микролитров PBS комнатной температуры и выдержите при комнатной температуре в течение трех минут для умывания. Теперь, чтобы получить вторичное антитело против го, разведите его в теплой среде ганглиев дорсального корня в соотношении один к 250. После завершения третьей промывки добавьте по 100 микролитров разведенного раствора вторичного антитела в каждую покровную промывку.

Инкубируйте покровные слипы при комнатной температуре в течение 40 минут, защищая клетки от света. Затем аспирируйте вторичный раствор антитела из покровных стекол и промойте клетки три раза, используя PBS, как описано ранее. После окончательной промывки PBS добавьте 100 микролитров раствора фиксатора, содержащего 4% параформальдегида, и 4% сахарозы в PBS.

После того, как клетки будут инкубированы при комнатной температуре в течение 10 минут, отсасывайте фиксатор из каждого покровного стекла. Затем трижды промойте клетки PBS, как описано ранее. Чтобы проникнуть в клетки, добавьте 100 микролитров 0,1% неионогенного детергента в PBS.

Выдержите покровные листики при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем отсадите проницаемый раствор из покровных стекол и промойте ячейки три раза, используя PBS, как описано ранее. Добавьте 100 микролитров блокирующего раствора, состоящего из 5% фетальной бычьей сыворотки, и 5% сыворотки осляка в PBS на каждую покровную пачку.

Затем разведите кроличий анти-CGRP, конъюгат биотина А-селектина В-4 и куриный анти-NFH в блокирующем растворе для приготовления специфической смеси первичных антител типа ганглиозных нейронов дорсального корня. Отсадите блокирующий раствор из покровных листков, затем добавьте по 100 микролитров приготовленной первичной смеси антител в каждый покровный листок. Инкубируйте чехлы при комнатной температуре в течение 45 минут, защищая их от света.

После этого удалите первичный раствор антитела из покровных стекол и промойте клетки три раза, используя PBS, как описано ранее. Теперь приготовьте смесь вторичных антител, разбавив стрептавидин, ослик против кролика и осла против курицы до 1 к 500 каждый в блокирующем растворе. Отсасывайте окончательную промывку PBS из каждой покровной полоски, затем добавьте 100 микролитров приготовленного раствора вторичного антитела.

Выдержать покровные слипы при комнатной температуре в течение 45 минут в темное время суток. Отсадите окончательную промывку из покровного стекла. С помощью щипцов с тонким кончиком поднимите каждую защитную пленку из парапленки и аккуратно промокните лишнюю жидкость, прикоснувшись краем покровной пленки к безворсовой салфетке.

Поместите каплю монтажной среды объемом семь микролитров на предметное стекло микроскопа. Осторожно опустите крышку на монтажный носитель стороной ячейки вниз, обеспечивая полный контакт со средой. Поместите подготовленные слайды в темный сухой ящик или коробку для просушки не менее чем на один час.

Заклейте край покровного стекла быстросохнущим лаком для ногтей и подождите от 10 до 15 минут, прежде чем делать снимок. Антитела, питающиеся живыми ганглиозными нейронами дорсальных корешков, выявили субпопуляцию нейронов с поверхностно доступными протеасомами, в то время как контрольные образцы, лишенные первичных антител, не показали поверхностного мечения. Проточная цитометрия идентифицировала две различные популяции ганглиозных нейронов дорсальных корешков, основываясь на интенсивности флуоресценции, отделив NMP-положительные клетки от NMP-отрицательных с установленными четкими гейт-областями с использованием контрольной группы.

Количественная оценка популяций, отсортированных по потоку, показала, что примерно 4% ганглиозных нейронов дорсального корешка были NMP-положительными, в то время как оставшаяся часть была NMP-отрицательной. Отсортированные NMP-положительные и NMP-отрицательные нейроны сохранили жизнеспособность и экспрессировали специфичные для типа клеток маркеры NFH, IB 4 и CGRP, что подтверждает пригодность рабочего процесса для последующего молекулярного анализа.