Подготовка Synaptoneurosomes от мыши Cortex использовании разрывных Перколла-Сахароза градиента плотности

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы получить трансляционно активный синап в нейрозоны из коры головного мозга мыши с использованием прерывистого перального градиента плотности сахарозы. Это достигается путем сбора и гомогенизации коры головного мозга мыши, а затем центрифугирования гомогената. После этого нанесите гомогенат центрифуги или супнатант на предварительный отчет по градиентам сахарозы.

Заключительным этапом является центрифугирование и сбор синаптосомной фракции. В конечном счете, вестерн-блоттинг и эксперименты по включению метионина S-35 показывают, что синаптосомная фракция синаптически обогащена и трансляционно активна. Основные преимущества этого метода перед существующими методами, такими как центрифугирование и фильтрация, заключаются в том, что первое механическое повреждение удается избежать за счет использования градиентов плотности, а второе на вызов имеет низкую токсичность по отношению к клеткам в их составляющих.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности с этим протоколом, потому что время играет ключевую роль. После того, как кортис был собран, процедура должна быть быстро завершена. Чтобы начать процедуру, приготовьте слои с градиентом 3, 10, 15 и 23%, добавив соответствующее количество SIP, как описано в сопроводительной рукописи, в буфер GM и хорошо перемешайте.

Налейте градиентные слои пипетированием по два миллилитра из каждого из 23, 15, 10 и 3%-ных изосмотических перольных растворов в центрифужные пробирки Бекмана с колпачками. С помощью пипетки P 1000 граница раздела между слоями должна быть четко различима, без смешивания слоев. Перед использованием храните градиент в четыре градуса Цельсия не менее 20 минут.

Прежде чем начать эту процедуру, подготовьте другие необходимые решения, как описано в сопроводительной рукописи. Усыпьте мышь в возрасте от 13 до 21 года и подготовьте ее к вскрытию, распылив на заднюю часть шеи и голову 70% этанола. Затем с помощью острых ножниц разрежьте спинной мозг у основания черепа.

Далее снимите кожу с верхней части черепа. Разрежьте череп латерально между теменной костью и межтеменной костью или между головным мозгом и областями коры головного мозга. После этого разрежьте череп от основания до носа по сагиттальному шву.

На этом этапе осторожно удалите мягкую теменную кость, оттягивая каждое полушарие в сторону. После этого вставьте шпатель в мозг над мозжечком, чтобы вычерпать кору. Поместите его в ледяной буфер GM и повторите процедуры снова, чтобы собрать больше коры головного мозга.

Теперь промойте кору головного мозга в ледяном буфере GM. Затем перенесите две коры головного мозга в гомогенизатор со стеклянным пухом, содержащий пять миллилитров холодного ГМ-буфера. Аккуратно гомогенизируйте кору головного мозга пятью-10 ударами пестика А, рассыпным пестом, за которым следуют пять-10 ударов пестика В, типа пестика.

Количество ходов варьируется в зависимости от конкретного гомогенизатора. Переложите гомогенат в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Центрифугируйте его при 1000 раз.

Гравитация в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в центрифуге Allegra six KR для гранулирования клеточного мусора и ядер. Нанесите два миллилитра супината на каждый пер или градиент сахарозы с одним градиентом на каждую целую кору головного мозга и закройте пробирки. Затем центрифугируйте их в роторе с фиксированным углом наклона под углом 32, 500 раз сильнее силы тяжести в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия в центрифуге Beckman J 2 21.

С помощью соответствующих адаптеров по завершении градиент должен дать мощный пипетку с полосой SN и отбросить раствор выше полосы SN. С помощью стеклянной макаронной пипетки пипетки отходят от полосы SN на границе от 15 до 23%, один градиент обычно дает от 0,9 до 1,1 миллилитров SNS. После этого переложите его в коническую пробирку и храните на льду.

Затем отрегулируйте концентрацию соли в СНС, добавив один 10-й объем в 10 раз больше стимулирующего буфера. По желанию добавьте в 1000 раз хлорид кальция, чтобы получить конечную концентрацию 12 аномоляров. Затем добавьте один миллимолярный запас TTX, чтобы получить конечную концентрацию в один микромоляр для подавления неспецифического возбуждения.

Следующим шагом является использование SNS в применимых последующих приложениях, таких как исследования трансляции белка. Для других применений лизат SN может быть очищен или концентрирован с помощью набора для подготовки образцов страницы Pierce SDS. Концентрацию белка в SNS можно определить с помощью набора для анализа белка micro BCA.

Вот пример шести полос или дробей. Когда кора головного мозга мыши была гомогенизирована и разделена на прерывистые перол-сахарозные градиенты, обогащенные SNS содержались в полосе 5 на границе от 23 до 15%, эта полоса была удалена и исследована с помощью электронной микроскопии. Пример интактных синаптических везикул и сохранение пресинаптических и постсинаптических элементов показаны здесь в вестерн-блоттинге.

Показано, что увеличение синаптических маркеров и уменьшение примесей в полосе SN от прерывистого градиента сахарозы подтверждают, что увеличение включения метионина S-35 при добавлении глутамата обусловлено синтезом белка de novo. Был добавлен 40 микромолярный анезианский мицин, ингибитор синтеза белка. На этом рисунке показано заметное снижение инкорпорации метионина S-35 в присутствии ансомицина с глутаматом или без него по сравнению с базальными уровнями.

Таким образом, прерывистые перальные градиенты сахарозы быстро производят высокоактивные и относительно чистые SNS, которые могут быть использованы для изучения трансляции белка. На этом рисунке показано, что пятая полоса от прерывистого градиента сахарозы на ядро содержит самые высокие уровни синтеза белка de novo. SNS, полученные путем пропускания гомогенизированной коры через ряд фильтров с уменьшением размера пор и последующего центрифугирования по прерывистому градиенту сахарозы для сравнения, содержат больше разорванных мембран и меньше целых SNS, чем SNS, приготовленные методом прерывистого перол-градиента сахарозы.

Показано, что СНС, приготовленные из более молодых мышей, обладают большей трансляционной активностью, чем старые мыши. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать трансляционно активные синаптические нейрозоны путем гомогенизации коры головного мозга мыши, центрифугирования гомогената в качающемся роторе ведра, центрифугирования надосадочной жидкости над градиентом сахарозы за звонок в роторе с фиксированным углом, а затем сбора полученной полосы синаптической нейрозоны.