Оптимизированный анализ белков из ооцитов и эмбрионов Xenopus с помощью иммуноблоттинга

В течение жизни животного постоянно происходят сульфатные решения, которые способствуют нормальному развитию и здоровью взрослого организма. Эти решения зависят от конкретных белков, относящихся к сульфатным регуляторам. Целью нашего исследования является поиск механизмов, которые управляют синтезом этих критических регуляторов.

В дополнение к подробному описанию иммуноблоттинга, ооцитов и эмбрионов Xenopus, наш протокол дает представление о проблемах, общих для этого модельного организма, таких как получение антител. Благодаря глубокому изучению механизмов связывания и репрессии Bicaudal C, наше исследование помогло создать информационную основу для сравнения других трансляционных регуляторов. Чтобы начать обработку клеток для иммуноблоттинга, на каждый эмбрион или ооцит добавляют 10 микролитров охлажденного буфера для лизиса клеток, разведенного до однократной концентрации с двукратной деионизированной водой.

С помощью микропестика гомогенизируйте образцы на льду. Поместите пробирки в настольную центрифугу и вращайте образцы при температуре 5 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы удалить мусор, включая желток и нерастворимые пигменты. Перенесите надосадочную жидкость в чистую 1,5-миллилитровую трубку, следя за тем, чтобы гранула не потревожилась во время переноса.

Добавьте к собранному надосадочной жидкости равный объем двукратного буфера для проб Laemmli с добавлением 5% массы к объему 2-меркаптоэтанола. Нагрейте смесь до 95-100 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы денатурировать белки. Теперь извлеките из упаковки сборный гель с содержанием SDS от 4 до 12% и снимите наклейку с нижней части геля.

Вставьте гель в электродный узел напротив буферной плотины и поместите весь узел в вертикальный резервуар для электрофореза. Затем заполните электродный узел и дно бака рабочим буфером Tris-MOPS-SDS. Аккуратно удалите гелевую расческу и пипетку с прогонным буфером в лунки, чтобы устранить пузырьки и сбалансировать буфер.

Теперь загрузите пять микролитров предварительно окрашенного стандарта белка в первую лунку и по 10 микролитров каждого подготовленного образца в остальные лунки. Закройте бак для электрофореза крышкой и подключите его к источнику питания. Затем установите напряжение на 200 вольт, чтобы начать электрофорез.

Остановите электрофорез после того, как передний слой красителя-буфера образца выйдет из геля. Прежде чем электрофорез завершится, начните сборку переходного сэндвича в зажиме для переноса. Наполните стеклянную форму для выпечки охлажденным буфером для переноса и погрузите в него все материалы для переноса во время сборки.

Поместите зажим для переноса в блюдо так, чтобы черная половина лежала на дне, белая половина была направлена вверх, а зажим был открыт влево. Положите одну или две волокнистые губки плашмя на черную половину зажима для переноса. Отрезав два куска бумаги для хроматографии толщиной 0,35 миллиметра по размеру, положите один сверху на губки.

После завершения электрофореза извлеките гель из резервуара для электрофореза. С помощью рычага открытия гелевой кассеты осторожно раздвиньте гелевые пластины, следя при этом за тем, чтобы гель оставался прикрепленным к одной стороне. Обрежьте лунки сверху геля с помощью релизера геля.

Поместите гель, все еще прикрепленный к одной половине пластиковой кассеты, на фильтровальную бумагу и снимите оставшуюся половину кассеты, чтобы гель оставался ровно на бумаге. Затем отрежьте кусок нитроцеллюлозной мембраны толщиной 0,45 микрометра, чтобы он соответствовал размерам геля. Снимите мембрану с защитной бумаги, кратковременно смочите ее в буфере для переноса и осторожно положите поверх геля.

Затем постелите второй лист фильтровальной бумаги поверх нитроцеллюлозной мембраны. С помощью валика аккуратно, но крепко выдавите все пузырьки воздуха. Положите одну или две дополнительные волокнистые губки поверх фильтровальной бумаги, чтобы завершить бутерброд.

Закройте кассету для переноса и плотно зафиксируйте ее, чтобы запечатать собранный бутерброд. Затем вставьте закрытый переходный сэндвич в переводной сердечник зажимом вверх и убедитесь, что черная сторона зажима обращена к черной стороне сердечника. Поместите передаточный сердечник в резервуар для электрофореза.

Добавьте в бак пакет со льдом и мешалку, чтобы она могла свободно вращаться. Наполните бак охлажденным буфером для переноса до полного погружения аппарата и закройте крышку сверху. Подключите аппарат к источнику питания, подберите цвета электродов и установите напряжение 100 вольт в течение одного часа при вращении мешалки.

Как только перенос будет завершен, осторожно откройте кассету и разберите бутерброд. Снимите нитроцеллюлозную мембрану и отметьте сторону, которая соприкасалась с гелем. Затем поместите нитроцеллюлозную мембрану в небольшую емкость так, чтобы она лежала ровно на дне.

Полностью покройте мембрану морилкой Понсо и аккуратно покачивайте на коромысле в течение 5-10 минут. После заливки пятна Понсо несколько раз промойте мембрану дважды деионизированной водой до тех пор, пока излишки пятна не будут удалены и на дорожках не станут видны белковые полосы. Затем выполните этапы блокировки мембраны, инкубации антител и промывания, как показано на рисунке.

После того, как инкубация и промывка вторичных антител завершены, мембрана готова к визуализации. В темном помещении включите проявитель пленки и дайте ей прогреться. Отрежьте два квадрата полиэтиленовой пленки достаточно большой, чтобы полностью покрыть мембрану.

С помощью щипцов поместите нитроцеллюлозную мембрану лицевой стороной вверх на первый квадрат полиэтиленовой пленки. В пробирке объемом 1,5 миллилитра смешайте равные объемы усиленного хемилюминесцентного люминола и усилителя реагентов. Затем используйте примерно один миллилитр смеси, чтобы покрыть большинство мембран.

Используя полиэтиленовую пленку, аккуратно манипулируйте мембраной, чтобы обеспечить равномерное покрытие всей поверхности, и инкубируйте в течение одной минуты. Затем удалите излишки реагента ECL, обхватив мембрану щипцами и слегка стряхнув жидкость. Поместите мембрану лицевой стороной вверх на второй квадрат полиэтиленовой пленки, свободно загните ее поверх мембраны и надежно заклейте пленку скотчем в авторадиографическую кассету.

Затем сфотографируйте мембрану с помощью авторадиографической пленки в темной комнате, выполнив показанные на рисунке действия. После того, как желаемая визуализация белка будет достигнута, совместите проявленную пленку со светящимися в темноте маркерами и используйте их в качестве ориентира для обозначения положения предварительно окрашенных белковых стандартов на пленке. После завершения визуализации осторожно снимите мембрану с полиэтиленовой пленки и погрузите ее в TBSTW, чтобы смыть остатки реагента ECL.

Окрашивание мембраны по Понсо подтвердило успешный перенос белка. Эндогенный белок B1 не был обнаружен в образцах ооцитов, но был четко обнаружен в образцах эмбрионов 7-й и 10,5-й стадий при концентрации около 107 килодальтонн. Меньшая полоса белка в 70 килодальтон была обнаружена во введенных образцах на всех стадиях с использованием антитела Bicc1, что указывает на успешную экспрессию слияния HA-Bicc1 C-концев.

Антитело к ГК обнаружило ту же полосу 70 килодальтон только во введенных образцах, подтвердив специфичность антитела Bicc1 к гибридному белку. Во всех образцах с использованием антитела CNOT1 были обнаружены две высокомолекулярные полосы, примерно 250 и 270 килодальтон. Экспрессия белка DDX6 с 54 килодальтонами была обнаружена во всех образцах, но заметно снизилась на стадии 10,5 эмбрионов.