Неймегенский гемостазный анализ: одновременное фторогенное измерение тромбина и плазмина в одной яме

Мои исследования сосредоточены на совместном измерении вторичного гемостаза и фибринолиза для измерения общего гемостатического баланса. Большинство современных анализов оценивают изолированные компоненты свертывания или фибринолиза. Этот анализ измеряет оба процесса одновременно в одном анализе.

Для начала включите считыватель флуоресцентной пластины и дайте ему уравновесить до 37 градусов Цельсия. Настройте настройки фильтра в программном обеспечении, установив количество пар длин волн в две. Установите длину волны возбуждения на 355 нанометров для тромбина и 485 нанометров для плазмина.

Затем установите длину волны излучения на 460 нанометров для тромбина и 525 нанометров для плазмина. Далее установите тип пластины на 96-колодную Greiner с плоским дном чёрной микропластины. Перейдите в область чтения и определите расположение пластины, используя максимум 20 колодц на пластину.

Настройте настройки PMT и оптики, установив усиление PMT на 200 вольт и количество вспышек на чтение на шесть. Затем перейдите в раздел «Тайминг», чтобы подтвердить настройки времени с общим временем работы один час девять минут и 30 секунд, интервалом 30 секунд. Перейдите в Shake, чтобы подтвердить трясение за три секунды до первого чтения.

Перейдите в раздел «Дополнительные настройки», чтобы убедиться, что порядок чтения установлен как Column. Настройте настройки Compound Transfer Before Read, установив No.of Compound Transfers на один, а начальный объём — на 120 микролитров. Проверьте, что высота пипетты — 130 микролитров, объём — 20 микролитров, скорость — один микролитр в секунду, а точка времени — 14 секунд.

В разделе Compound Source подтвердите формат 96 Well Compound Plate и конкретно выберите вариант Beckman 96 объёмом 2,3 миллилитра. Проверьте настройки Pipette Tips Layout, выбрав правильные столбцы. Теперь перейдите к столбцам Compound Tips и выберите нужные столбцы.

Установите температуру шейкера микропластин на 37 градусов Цельсия и проверьте температуру перед использованием. Затем установите интенсивность тряски на 1000 оборотов в минуту. Затем разморозить плазму пациента и обычную сгруппированную плазму в водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия до 10 минут.

Тщательно перемешайте образцы плазмы и проверьте полное оттаивание без видимого криопреципитата. С помощью пипетки добавьте 80 микролитров плазмы пациента или нормальной сгруппированной плазмы в заранее выбранные колодцы, используя свежий наконечник пипетки для каждого образца. Затем подготовьте субстратную смесь, смешав 48 микролитров цефалина с 48 микролитрами тканевого фактора.

К этому добавляют 240 микролитров буфера хлорида тринатрия, затем пипетку на 96 микролитров тромбинного субстрата и 48 микролитров плазминного субстрата. Пипетить по 20 микролитров субстратной смеси в каждую колодцу. Потом пожмите руки.

Теперь вставьте микропластину в считыватель флуоресцентной пластины и дайте ей уравновеситься при 37 градусах Цельсия в течение нескольких минут. Комбинируйте буфер тринатрия хлорида, буфер хлорида натрия и хлорида кальция и активатор плазминогена тканей для подготовки стартового реагента. Тщательно перемешайте Vortex.

Пипетировать исходную реагентную смесь во всех строках составного столбца. Вставьте пластину с исходной смесью реагента в исходный ящик и начните измерение флуоресценции. Записывайте флуоресцентные сигналы каждые 30 секунд в течение 70 минут.

Поддерживайте пластину при 37 градусах Цельсия на протяжении всего измерения. Для анализа данных экспортируйте данные кинетической флуоресценции в таблицу с временными точками и значениями флуоресценции на каждую скважину. Вычислите первую производную и постройте кривые генерации ферментов для каждой ямы, чтобы визуализировать генерацию тромбина или плазмина со временем.

Гемостазный анализ позволил одновременно измерять тромбин и генерацию плазминов с ограничением времени, обеспечивая интегрированную оценку свертывания и фибринолиза. Из кривой генерации тромбина можно вывести несколько параметров, включая время задержки, максимальную высоту и потенциал тромбина. Более длительные задержки, более низкие пиковые высоты и снижение тромбиновых потенциалов указывают на нарушение генерации тромбина.

Кривая генерации плазмина также содержит несколько параметров, включая время лизиса фибрина и максимальную высоту плазмина. Более короткие время лизиса фибрина и более высокие пиковые высоты отражают усиленную генерацию плазмы. Кривые генерации тромбина и плазмы из трёх здоровых контрольных и нормальной объединённой плазмы показали воспроизводимое время завершения пиковой высоты, служа эталонными профилями для нормальной функции гемостатической системы.

У пациента с фактором V активность 3% тромбина была полностью отсутствующей. Однако генерация плазмы немного увеличилась. У пациента с активностью фактора V 44% наблюдалась сниженная генерация тромбина с длительной задержкой и уменьшением пиковой высоты, в то время как генерация плазмы оставалась в пределах нормы.

При дефиците альфа-2-антиплазмина генерация плазмы увеличивалась с уменьшением активности альфа-2-антиплазмина. У гомозиготного пациента с активностью 23% наблюдалось раннее начало генерации плазмина, сокращение времени лизисирования фибрина и более высокий пик плазмы. Эти изменения также наблюдались у гетерозиготного пациента с активностью 73%, хотя они были менее выраженными.

Гемостазный анализ хорошо подходит для исследований дефицита редких факторов свертывания, фибринолитических заболеваний и эффектов гемостатических препаратов. Основные задачи — стандартизация метода и нормализация результатов для повышения сопоставимости между помещениями и лабораториями. Будущие исследования могут быть сосредоточены на автоматизации анализа и разработке адаптаций для совместимости с цельной кровью или плазмой, богатой пластинами.