Микроскопия локализации мембранных белков с использованием одномолекулярной метки
20 марта 2026 г.
Этот протокол описывает маркировку одного антитела (SAL) для разрешения наномасштабной пространственной организации белков плазматической мембраны. Используя кумулятивные взаимодействия антитела и эпитопов на уровне одной молекулы, мембранный SAL (mSAL) картирует локальное распределение эпитопов, одновременно фиксируя поведение связывания антител в родной клеточной среде.
Мои исследования сосредоточены на мембране Т-клеток и направлены на выявление новых наноуровневых инсайтов, важных для терапевтического таргетинга. Существующие методы визуализации обычно не визуализируют наномасштабные взаимодействия антитела и эпитопов в клетках. Этот протокол преодолевает это ограничение, позволяя осуществлять прямое наблюдение внутри клеточной среды.
После установки образца на микроскоп и нанесения золотых коллоидов на поверхность используйте яркое освещение, чтобы убедиться, что в интересующей области отложено достаточно коллоидов. Убедитесь, что оптимальная плотность от 5 до 10 золотых коллоидов присутствует в интересующей области, прежде чем продолжать. Для оптической конфигурации фторофора антитела откройте программное обеспечение визуализации и получите доступ к оптическим настройкам.
Выберите подходящее дихроическое зеркало и установите длину волны возбуждения лазера и плотность мощности. Отрегулируйте время интеграции камеры и выберите фильтр излучения. Затем установите биннинг пикселей камеры так, чтобы размер пикселей составлял от 150 до 160 нанометров.
Теперь создайте оптическую конфигурацию для этапа отбеливания фотографий, выбрав режим отбеливания фото в программном обеспечении. Установите мощность лазера на 100% и отрегулируйте время интеграции камеры на одну секунду. Задайте параметры изображения в программном обеспечении для получения изображений, определив интервал без освещения, количество кадров и частоту этапа отбеливания фотографии.
Далее подготовьте буфер для визуализации, разбавляя антитело CD81 до концентрации 1 микрограмм на миллилитр в 200 микролитрах 5% BSA, полученных в DPBS. Окончательная рекомендуемая концентрация антител составляет 0,5 наномоляра для Т-клеток Jurkat или 2 наномоляра для клеток U-2 OS. Добавьте подготовленный буфер изображения в яму, содержащую ячеки, и начните получение изображений в программном обеспечении для сбора данных.
Используйте функцию live view в программном обеспечении визуализации, настроенной на маркировку мембранных одиночных антител, чтобы отслеживать связывание антител в реальном времени. Настройте параметры изображения в программном обеспечении для получения не менее 10 кадров и установите интервал без освещения на пять секунд. Начните получение и оцените разрежённость локализаций отдельных молекул в записанном фильме.
Если сразу после добавления буфера визуализации наблюдается несколько перекрывающихся событий связывания антител или если со временем накапливаются локализации отдельных молекул, процесс прекращается. Уменьшите концентрацию антител вдвое и повторите получение на новом образце. Продолжайте удвоить снижение концентрации антител и переоценивать количество событий на единицу площади до достижения желаемой плотности локализации одной молекулы.
Если плотность событий невелика, увеличьте концентрацию антител в буфере визуализации вдвое. Повторить получение на новом образце и продолжать увеличивать концентрацию антител вдвое, пересчитывая количество событий связывания на единицу площади, пока не будет достигнута желаемая плотность локализации одной молекулы. Для оптимизации интервалов без освещения настройте параметры изображения в программном обеспечении для получения 50-кадрового захвата.
После добавления антитела и начала приобретения оценивайте плотность и разрежённость локализаций отдельных молекул в записанном фильме. Определите минимальный интервал без освещения, который даёт оптимальную плотность событий для одной молекулы. Наконец, если пространственно перекрывающиеся события связывания пространственно происходят по мере продвижения изображения, введите этап фотоотбеливания с регулярными интервалами.
Скорректируйте частоту фотоотбеливания так, чтобы флуоресценция от связанных антител была удалена до накопления перекрывающихся событий. Установите путь файла в программном обеспечении MATLAB на папку, содержащую восстановленный файл значений M-ячейки с разделёнными запятыми. Запустите код, нажав «Запустить» в панели инструментов MATLAB.
При запросе выберите CSV-файл M ячейки и нажмите «Открыть», чтобы загрузить его в программу. Проведите анализ, используя ранее определённые входные данные в качестве отправной точки. Оценка диаграммы рассеяния, содержащей некластерные данные локализации.
Выберите минимальное точечное значение, которое превышает количество локализаций шума, но меньше количества локализаций на ячейке. Оцените окно, отображающее сгруппированные данные. Подтвердите, что кластеры сохраняются на клетке с ожидаемым фенотипом, при этом локализации вне клетки минимизированы.
Если параметры кластеризации слишком ограничительны, уменьшите минимальное значение очков и увеличите эпсилон. Если параметры кластеризации слишком инклюзивны, увеличьте минимальное значение очков и уменьшите эпсилон. Наконец, после корректировки минимального значения очков и эпсилона, запустите код заново для оптимальной кластеризации.
Т-клетки Jurkat были обездвижены с достаточным расстоянием для сохранения целостности мембраны и обеспечения доступа антител к мембранным эпитопам. Золотые коллоиды визуализировались и использовались в качестве фидуциальных маркеров для коррекции бокового дрейфа при получении изображений M-клеток. Оптимизация интервала без освещения показала, что пятисекундный интервал вызывает события связывания антител с минимальным пространственным перекрытием по сравнению с короткими или более длинными интервалами при концентрации одного наномоляра.
Применение коррекции дрейфа улучшило реконструированное изображение ячеек M по сравнению с некорректированной реконструкцией. Плотностная кластеризация M-клеток локализировала фоновые взаимодействия низкой плотности и выделяла кластерные события связывания CD81. Мы можем наблюдать, как антитела взаимодействуют с эпитопами мембраны в клеточной среде, что даёт информацию, важную для терапевтических антител.
Концентрация антител, интервал отсутствия освещения и этапы фотоотбеливания критически важны для оптимизации. Неоптимальные параметры могут навредить результатам. Маркировка одного антитела может быть расширена для одновременной оценки связывания белков мембраны несколькими антителами в одной клеточной среде.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол демонстрирует метки с одним антителом (SAL) для визуализации наноразмерных взаимодействий антитела-эпитопа в мембранах Т-клеток. Он предоставляет метод для картирования локальных распределений эпитопов и захвата поведения связывания антител в их естественной клеточной среде.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биоинженерия
- Клеточная биология
- Методы визуализации
Предыстория
- Существующие методы визуализации часто не позволяют напрямую визуализировать наноразмерные взаимодействия.
- Понимание взаимодействий антитела-эпитоп важно для терапевтического нацеливания.
- Этот метод позволяет мониторинуть связывание антител в реальном времени.
- Микроскопия локализации одиночных молекул повышает разрешение в клеточной визуализации.
Цель исследования
- Разработать протокол для метки одного антитела мембранных белков.
- Оптимизировать параметры визуализации для эффективной визуализации связывания антител.
- Предоставить представление о пространственной организации мембранных белков.
Используемые методы
- Приготовление буфера для визуализации с определенными концентрациями антител.
- Настройка программного обеспечения для визуализации для оптимальных настроек получения изображений.
- Оценка плотности локализации одиночных молекул путем постепенных корректировок.
- Применение коррекции дрейфа и фотоотбеливания для улучшения качества изображения.
Основные результаты
- Оптимальная концентрация антител и параметры визуализации имеют критическое значение для успешной локализации.
- Коррекция дрейфа улучшает качество реконструкции изображений.
- Метка одного антитела может быть распространена на несколько антител в одной среде.
- Мониторинг в реальном времени позволяет вносить корректировки для минимизации перекрывающихся событий.
Выводы
- Этот протокол позволяет детально наблюдать взаимодействия антител с мембранными белками.
- Он предоставляет рамки для изучения терапевтических антител в клеточном контексте.
- Оптимизация параметров визуализации важна для точных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Single-molecule localization microscopy (SMLM) with single-antibody labeling enables direct nanoscale visualization of membrane protein organization and antibody-epitope interactions in live cells. This capability is highly relevant for therapeutic antibody development, providing predictive confidence in target engagement and mechanistic de-risking at the earliest stages of discovery. The approach supports portfolio decisions by clarifying membrane protein distribution and pharmacodynamics in native cellular environments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Directly visualizes antibody-epitope interactions on live cell membranes, supporting functional target validation.
- Enables mechanistic de-risking by revealing nanoscale protein clustering and distribution patterns.
- Improves predictive confidence in antibody binding specificity and localization.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging parameters for reproducible single-molecule detection in screening workflows.
- Supports quantitative assessment of antibody binding events for assay standardization.
- Facilitates reliable evaluation of candidate antibodies in physiologically relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns membrane protein mapping with translational biomarker strategies when studying therapeutic antibody pharmacodynamics.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling in situ analysis of antibody-target interactions.
- Reduces biological risk by confirming target accessibility and distribution in disease-relevant cell models.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative analysis of antibody-membrane interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of membrane protein organization and antibody binding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative single-molecule readouts for candidate evaluation.
- Analytics: Provides density-based cluster analysis and drift-corrected localization data for robust comparison across conditions.
- Translational Research: Enables pharmacodynamic studies of therapeutic antibodies in native cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable imaging workflow for diverse membrane protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in antibody-target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging and analysis parameters for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying target engagement early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antibody candidates based on direct cellular evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced fluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Needs access to high-resolution imaging platforms and analytical software for drift correction and cluster analysis.
- Demands rigorous optimization of antibody concentration, illumination intervals, and photo bleaching steps for each system.
- Must standardize protocols across cell types and antibody reagents for cross-study comparability.
- Limited by the need for careful parameter tuning to avoid overlapping events and ensure single-molecule resolution.
