Микроскопия локализации мембранных белков с использованием одномолекулярной метки

Мои исследования сосредоточены на мембране Т-клеток и направлены на выявление новых наноуровневых инсайтов, важных для терапевтического таргетинга. Существующие методы визуализации обычно не визуализируют наномасштабные взаимодействия антитела и эпитопов в клетках. Этот протокол преодолевает это ограничение, позволяя осуществлять прямое наблюдение внутри клеточной среды.

После установки образца на микроскоп и нанесения золотых коллоидов на поверхность используйте яркое освещение, чтобы убедиться, что в интересующей области отложено достаточно коллоидов. Убедитесь, что оптимальная плотность от 5 до 10 золотых коллоидов присутствует в интересующей области, прежде чем продолжать. Для оптической конфигурации фторофора антитела откройте программное обеспечение визуализации и получите доступ к оптическим настройкам.

Выберите подходящее дихроическое зеркало и установите длину волны возбуждения лазера и плотность мощности. Отрегулируйте время интеграции камеры и выберите фильтр излучения. Затем установите биннинг пикселей камеры так, чтобы размер пикселей составлял от 150 до 160 нанометров.

Теперь создайте оптическую конфигурацию для этапа отбеливания фотографий, выбрав режим отбеливания фото в программном обеспечении. Установите мощность лазера на 100% и отрегулируйте время интеграции камеры на одну секунду. Задайте параметры изображения в программном обеспечении для получения изображений, определив интервал без освещения, количество кадров и частоту этапа отбеливания фотографии.

Далее подготовьте буфер для визуализации, разбавляя антитело CD81 до концентрации 1 микрограмм на миллилитр в 200 микролитрах 5% BSA, полученных в DPBS. Окончательная рекомендуемая концентрация антител составляет 0,5 наномоляра для Т-клеток Jurkat или 2 наномоляра для клеток U-2 OS. Добавьте подготовленный буфер изображения в яму, содержащую ячеки, и начните получение изображений в программном обеспечении для сбора данных.

Используйте функцию live view в программном обеспечении визуализации, настроенной на маркировку мембранных одиночных антител, чтобы отслеживать связывание антител в реальном времени. Настройте параметры изображения в программном обеспечении для получения не менее 10 кадров и установите интервал без освещения на пять секунд. Начните получение и оцените разрежённость локализаций отдельных молекул в записанном фильме.

Если сразу после добавления буфера визуализации наблюдается несколько перекрывающихся событий связывания антител или если со временем накапливаются локализации отдельных молекул, процесс прекращается. Уменьшите концентрацию антител вдвое и повторите получение на новом образце. Продолжайте удвоить снижение концентрации антител и переоценивать количество событий на единицу площади до достижения желаемой плотности локализации одной молекулы.

Если плотность событий невелика, увеличьте концентрацию антител в буфере визуализации вдвое. Повторить получение на новом образце и продолжать увеличивать концентрацию антител вдвое, пересчитывая количество событий связывания на единицу площади, пока не будет достигнута желаемая плотность локализации одной молекулы. Для оптимизации интервалов без освещения настройте параметры изображения в программном обеспечении для получения 50-кадрового захвата.

После добавления антитела и начала приобретения оценивайте плотность и разрежённость локализаций отдельных молекул в записанном фильме. Определите минимальный интервал без освещения, который даёт оптимальную плотность событий для одной молекулы. Наконец, если пространственно перекрывающиеся события связывания пространственно происходят по мере продвижения изображения, введите этап фотоотбеливания с регулярными интервалами.

Скорректируйте частоту фотоотбеливания так, чтобы флуоресценция от связанных антител была удалена до накопления перекрывающихся событий. Установите путь файла в программном обеспечении MATLAB на папку, содержащую восстановленный файл значений M-ячейки с разделёнными запятыми. Запустите код, нажав «Запустить» в панели инструментов MATLAB.

При запросе выберите CSV-файл M ячейки и нажмите «Открыть», чтобы загрузить его в программу. Проведите анализ, используя ранее определённые входные данные в качестве отправной точки. Оценка диаграммы рассеяния, содержащей некластерные данные локализации.

Выберите минимальное точечное значение, которое превышает количество локализаций шума, но меньше количества локализаций на ячейке. Оцените окно, отображающее сгруппированные данные. Подтвердите, что кластеры сохраняются на клетке с ожидаемым фенотипом, при этом локализации вне клетки минимизированы.

Если параметры кластеризации слишком ограничительны, уменьшите минимальное значение очков и увеличите эпсилон. Если параметры кластеризации слишком инклюзивны, увеличьте минимальное значение очков и уменьшите эпсилон. Наконец, после корректировки минимального значения очков и эпсилона, запустите код заново для оптимальной кластеризации.

Т-клетки Jurkat были обездвижены с достаточным расстоянием для сохранения целостности мембраны и обеспечения доступа антител к мембранным эпитопам. Золотые коллоиды визуализировались и использовались в качестве фидуциальных маркеров для коррекции бокового дрейфа при получении изображений M-клеток. Оптимизация интервала без освещения показала, что пятисекундный интервал вызывает события связывания антител с минимальным пространственным перекрытием по сравнению с короткими или более длинными интервалами при концентрации одного наномоляра.

Применение коррекции дрейфа улучшило реконструированное изображение ячеек M по сравнению с некорректированной реконструкцией. Плотностная кластеризация M-клеток локализировала фоновые взаимодействия низкой плотности и выделяла кластерные события связывания CD81. Мы можем наблюдать, как антитела взаимодействуют с эпитопами мембраны в клеточной среде, что даёт информацию, важную для терапевтических антител.

Концентрация антител, интервал отсутствия освещения и этапы фотоотбеливания критически важны для оптимизации. Неоптимальные параметры могут навредить результатам. Маркировка одного антитела может быть расширена для одновременной оценки связывания белков мембраны несколькими антителами в одной клеточной среде.