Одновременное Многоцветный изображений биологических структур с флуоресцентной фотоактивации локализации микроскопии

Общая цель данной процедуры заключается в одновременной визуализации нескольких видов белков с нанометровой точностью в фиксированных или живых клетках. Для этого сначала настраивается положение камеры и оптики до тех пор, пока сфокусированное изображение с микроскопа не будет проецироваться на чип камеры. На втором этапе лазерные лучи направляются таким образом, чтобы они были точно совмещены с образцом на предметном столике микроскопа.

Затем подготовленный образец клеток освещают и выбирают клетку, экспрессирующую искомые белки. Заключительным этапом является получение изображения клетки методом флуоресцентной фотоактивационной локализационной микроскопии путем освещения образца лазерами с последующим направлением флуоресценции клетки на чип камеры для сбора набора данных. В конечном счете, флуоресцентная фотоактивационная локализационная микроскопия используется для демонстрации локализации нескольких видов белков с нанометровым пространственным разрешением в фиксированных или живых клетках, как в режиме широкопольного освещения, так и при использовании внутреннего полного отражения для выделения тонкого слоя образца.

Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как конфокальная или электронная микроскопия, является возможность одновременной визуализации нескольких белков с нанометровым разрешением в фиксированных или живых клетках. В следующих шагах используется система нумерации, представленная здесь на схеме установки для многоцветной F Om (рисунок 1 в сопроводительном текстовом протоколе). Чтобы выровнять микроскоп, начните с размещения калибровочной шкалы или мишени на предметном столике микроскопа, установив объектив 10 x и включив лампу проходящего света. Центрируйте вертикальную линию по центру поля зрения.

Затем настройте микроскоп для получения коэрэнтного освещения, закрыв полевую диафрагму и глядя через окуляры вертикально. Если края полевой диафрагмы расфокусированы, отрегулируйте высоту конденсатора до тех пор, пока и полевая диафрагма, и предметный столик не окажутся в фокусе. Затем отрегулируйте боковое положение полевой диафрагмы, пока она не будет центрирована относительно поля зрения, и закройте полевую диафрагму так, чтобы была освещена только центральная сетка на предметном столике.

При первой сборке этих компонентов отрегулируйте длину пути каждого канала таким образом, чтобы они были равны. Для выполнения этой задачи переместите объектив камеры, настраивая зеркала семь и девять, и закройте апертуру детектора, чтобы предотвратить пространственное перекрытие двух каналов. Затем сфокусируйте изображение радика в канале отраженного света и проверьте, находится ли оно также в фокусе в канале прошедшего света.

Если изображение в канале проходящего света не в фокусе, перемещайте зеркало девять до тех пор, пока изображение радикала не станет четким одновременно в обоих каналах. Начните юстировку лазеров, удалив линзу один из пути луча лазера и перекрыв лучи активации и считывания. Затем приложите белую карточку вплотную к зеркалу четыре, откройте затвор микроскопа и сфокусируйтесь так, чтобы изображение радикала проецировалось на карточку перед зеркалом четыре.

Затем откройте доступ для считывающего луча и отрегулируйте зеркало один так, чтобы считывающий лазер был центрирован по перекрестию изображения радика на зеркале четыре. После центрирования спроецируйте изображение радика на зеркало пять и отрегулируйте зеркало четыре до тех пор, пока луч не будет центрирован по перекрестию изображения на зеркале пять. Теперь считывающий луч должен быть центрирован как на зеркале M четыре, так и на M пять.

Затем заблокируйте считывающий луч, закрыв затвор один. Далее спроецируйте изображение радикала на зеркало три. Удалите расширитель пучка из траектории лазера и разблокируйте активационный лазер.

Теперь отрегулируйте второе зеркало так, чтобы центрировать луч активации по перекрестию изображения радикала на третьем зеркале. После центрирования установите расширитель пучка между вторым и третьим зеркалами и отрегулируйте положение расширителя пучка до тех пор, пока луч не будет центрирован по перекрестию изображения радикала. На третьем зеркале спроецируйте изображение радикала на пятое зеркало и сфокусируйте его.

С помощью ручки фокусировки микроскопа отрегулируйте угол наклона дихроичного зеркала номер один так, чтобы луч активации был центрирован по изображению красного светодиода. Затем заблокируйте активационный лазер, закрыв затвор два (при отсутствии объектива в патроннике и открытом затворе микроскопа). Откройте затвор считывания (затвор один) и спроецируйте лазер через заднюю апертуру микроскопа.

Отрегулируйте зеркало пять до тех пор, пока луч не выйдет из микроскопа; луч должен выходить из микроскопа вертикально, при этом линза один и объектив должны быть установлены на свои места. Поместите на предметный столик образец, содержащий 100 micromolar бромина B, при заблокированном активационном лазере. Направьте считывающий лазер через объектив 60 x в краситель.

Отключите усиление электронного размножения. Передайте это изображение на камеру. Затем сфокусируйте объектив на образце.

Откройте апертуру достаточно широко, чтобы обеспечить визуализацию полного профиля пучка. Затем переместите апертуру латерально так, чтобы центр профиля пучка и апертура были концентричны. С помощью программного обеспечения камеры выберите область интереса таким образом, чтобы область считывания камеры была минимальной, но охватывала оба канала, и зафиксируйте эти координаты.

На этом этапе сделайте один снимок, который будет представлять профиль считывающего луча. Затем перекройте считывающий лазер, закрыв затвор один, и откройте затвор два. Чтобы приступить к измерению профиля активирующего луча, направьте активирующий лазер на образец; при необходимости установите коэффициент усиления электронного умножителя менее 100 и отрегулируйте первое дихроичное зеркало до тех пор, пока луч не окажется центрированным в каждом поле зрения.

Затем зафиксируйте профиль луча активации, чтобы начать получение многоцветных изображений F-palm. Выключите все освещение в помещении. Затем с помощью поворотного крепления направьте свет ртутной лампы на трансфицированные клетки и замените фильтр-куб на тот, который содержит соответствующую длину волны возбуждения для предварительного фотопереключаемого состояния.

После выбора клетки опустите поворотный держатель, чтобы лазерные лучи могли попасть в микроскоп, и переключите барабан фильтров на тот, который содержит соответствующее дихроичное зеркало для визуализации, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Затем выведите это изображение на камеру, чтобы отличить трансфицированные клетки от фоновой флуоресценции и подтвердить, что молекулы пригодны для фотоактивации. Кратковременно осветите образец активационным лазером с низкой мощностью менее 10 µW.

Затем подготовьте программное обеспечение камеры для регистрации кинетической серии, установив коэффициент усиления электронного умножителя на 200, а желаемое количество кадров — в диапазоне от 5 до 10 000. Также установите время экспозиции от 10 до 30 миллисекунд. Затем заблокируйте луч активации, разблокируйте луч считывания и спроецируйте изображение освещенной клетки на камеру.

Выберите фокальную плоскость рядом с нижней клеточной мембраной, перемещая фокус вниз до тех пор, пока отдельные молекулы не перестанут быть видимыми. Затем постепенно перемещайте фокус вверх, пока молекулы снова не станут видны. Теперь разблокируйте активационный луч и облучите образец с интенсивностью менее одного ватта на квадратный сантиметр.

Начните сбор этих данных с помощью программного обеспечения камеры, поддерживая плотность от 0,1 до одного видимого фотоактивируемого молекулы на квадратный микрон путем динамической регулировки нейтрального светофильтра перед активационным лазером. Для получения изображений методом флуоресценции с полным внутренним отражением установите зеркало пять и линзу один на одну общую стадию перемещения для латерального смещения непосредственно за входом в микроскоп. По мере перемещения зеркала пять и линзы один лазерные лучи, выходящие из объектива вверх через образец, будут постепенно отклоняться в сторону; продолжайте перемещать стадию до тех пор, пока угол наклона лазеров не достигнет 90 градусов относительно вертикали.

На данном этапе выходящий лазерный луч исчезнет, а падающий лазер будет отражен обратно в апертуру, двигаясь антипараллельно падающему пучку и смещаясь в сторону. Вы должны заметить снижение фонового сигнала, когда образец перейдет в режим флуоресценции при полном внутреннем отражении. После завершения сбора изображений немедленно закройте затвор микроскопа и заблокируйте оба луча. Отключите усиление электронного умножителя.

Настройте камеру на запись одного кадра и установите область считывания камеры на максимальный размер. Наконец, заблокируйте один канал, поместив карточку над F three или F four с установленным на лампе микроскопа длинноволновым фильтром. Осветите образец и спроецируйте полученное изображение на камеру.

Сделайте снимок клетки в проходящем свете для репрезентации всей клетки. Здесь представлен пример двухцветного сбора данных F-PALM клетки NIH 3T3, экспрессирующей DENDRA2-гемагглютинин и PAM-Cherry-актин. Канал проходящего света слева содержит более длинные волны, чем канал отраженного света справа.

Здесь представлены снимки, полученные с помощью двухцветной ОМ-микроскопии, после вычитания фона и трансформации для наложения левого и правого каналов. Можно идентифицировать и локализовать отдельные молекулы. Некоторые молекулы выглядят более яркими в канале пропускания, а другие имеют более равномерное распределение эмиссии между двумя каналами.

Это указывает на различие в спектрах испускания между PAM cherry и DENDRA two соответственно и используется при анализе для идентификации этих двух видов. Представленная здесь гистограмма отображает отношение интенсивности красного пропускающего канала к общей интенсивности для всех локализованных молекул после применения допусков. Пиксели выглядят белыми на нижнем левом изображении и красными на итоговом совмещенном изображении внизу справа, в то время как пиксели в зеленой области выглядят белыми на верхнем правом изображении и зелеными на итоговом совмещенном изображении внизу справа.

Пороговые уровни, выбранные при визуализации, существенно влияют на степень шума и внешний вид колокализации. Здесь представлены три различных варианта визуализации, приводящих к разной степени перекрытия сигналов (bleed through); наиболее консервативные пороговые уровни показаны на двух нижних изображениях. Гистограммы Color F palm alpha проще всего интерпретировать, когда на изображении отчетливо видны два пика.

В то время как гистограмма слева является подходящим кандидатом для дальнейшего анализа, интерпретировать изображения, полученные на основе двух других гистограмм при использовании данной процедуры, будет гораздо сложнее. Для ответа на дополнительные вопросы, например, о том, как белки организованы на наноуровне в мембранах живых клеток, могут быть применены такие методы, как микроскопия полного внутреннего отражения и визуализация живых клеток. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как настроить собственный микроскоп FAR и использовать его для сбора данных.

Не забывайте, что работа с лазерами может быть крайне опасной, поэтому перед выполнением данной процедуры необходимо пройти инструктаж по технике безопасности.