Одновременное Многоцветный изображений биологических структур с флуоресцентной фотоактивации локализации микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном изображении нескольких видов белка с нанометровой точностью в неподвижных или живых клетках. Это достигается путем предварительной регулировки положения камеры и оптики до тех пор, пока сфокусированное изображение с микроскопа не будет проецироваться на чип камеры. Второй шаг — расположить лазерные лучи так, чтобы они были непосредственно выровнены по образцу на предметном столике микроскопа.

Далее подготовленный образец клетки подсвечивают и выбирают клетку, экспрессирующую нужные белки. Заключительным этапом является получение изображения клетки с помощью флуоресцентной фотоактивационной микроскопии локализации путем освещения образца лазерами, а затем направления флуоресценции клетки на чип камеры для получения набора наборов данных. В конечном счете, флуоресцентная фотоактивационная микроскопия используется для демонстрации локализации нескольких видов белков в нанометровом пространственном масштабе в неподвижных или живых клетках и либо в широком поле, либо при использовании флуоресценции полного внутреннего отражения для выделения тонкой области образца.

Основное преимущество этого метода перед существующими методами, такими как конфокальная или электронная микроскопия, заключается в том, что в неподвижных или живых клетках можно одновременно визуализировать несколько белков с нанометровым разрешением. Следующие шаги относятся к системе нумерации, показанной здесь, которая представляет собой схему многоцветной установки F Om, представленной на рисунке 1 в сопроводительном текстовом протоколе, для выравнивания микроскопа начинается с размещения калибровочной шкалы или радикала на предметном столике микроскопа с объективом 10 x и лампой, установленной для пропускаемого света. Центрируйте вертикаль в центре поля зрения.

Далее отрегулируйте микроскоп для принудительного освещения, закрыв диафрагму поля и глядя через окуляры по вертикали. Если края диафрагмы поля не сфокусированы, отрегулируйте высоту конденсора до тех пор, пока и апертура поля, и красный окажутся в фокусе. Затем отрегулируйте боковое положение апертуры поля зрения до тех пор, пока она не будет центрирована по отношению к полю зрения, и закройте апертуру поля до тех пор, пока не будет освещена только центральная сетка на красном экране.

При первой сборке этих компонентов отрегулируйте длину пути каждого канала, чтобы она была равна. Чтобы выполнить этот проект, чип камеры отрегулирует седьмое и девятое зеркала и закроет апертуру обнаружения, чтобы предотвратить пространственное перекрытие между двумя каналами. Затем сфокусируйте изображение радикала в канале отраженного света и проверьте, находится ли он также в фокусе в канале проходящего света.

Если изображение в проходящем световом канале не находится в фокусе, перемещайте зеркало девять до тех пор, пока радикальное изображение не окажется в фокусе одновременно в обоих каналах. Начните юстировку лазеров с удаления линзы из лазерной траектории и блокирования лучей активации и считывания. Затем поместите белую карту заподлицо с четвертым зеркалом, откройте затвор микроскопа и сфокусируйтесь до тех пор, пока радикальное изображение не спроецируется на карту перед четвертым зеркалом.

Затем разблокируйте считывающий луч и отрегулируйте первое зеркало, чтобы центрировать считывающий лазер на перекрестии радикального изображения на четвертом зеркале. После центрирования спроецируйте радикальное изображение на пятое зеркало и отрегулируйте четвертое зеркало до тех пор, пока луч не будет центрирован на перекрестье изображения пятого зеркала. Теперь луч считывания должен быть центрирован как на М четыре, так и на М пять.

Затем заблокируйте луч считывания, закрыв первую заслонку. Затем спроецируйте радикальное изображение на третье зеркало. Снимите расширитель луча с лазерной траектории и разблокируйте активационный лазер.

Теперь отрегулируйте второе зеркало, чтобы центрировать активационный луч на перекрестии радикального изображения на третьем зеркале. После центрирования установите расширитель луча между вторым и третьим зеркалами и отрегулируйте положение расширителя луча до тех пор, пока луч не будет центрирован на перекрестии изображения радикала. На третьем зеркале спроецируйте радикальное изображение на пятое зеркало и сфокусируйтесь.

С помощью ручки фокусировки микроскопа отрегулируйте угол дихроичного зеркала номер один до тех пор, пока активационный луч не будет центрирован на красном изображении. Затем заблокируйте активацию лазера, закрыв второй затвор без объектива и открыв затвор микроскопа. Откройте считывающий затвор и спроецируйте лазер через заднюю апертуру микроскопа.

Отрегулируйте пятое зеркало до тех пор, пока луч не выйдет из микроскопа, чтобы луч выходил из микроскопа вертикально с линзой один и объективом на месте. Поместите образец, содержащий 100 микромоляров брома В, на предметный столик с заблокированным лазером активации. Проецируйте считывающий лазер через объектив с 60-кратным увеличением на краситель.

При отключенном усилении умножения электронов. Отправьте это изображение на камеру. Затем сфокусируйте объектив на образце.

Откройте апертуру достаточно широко, чтобы можно было получить изображение профиля полного луча. Затем переместите апертуру в сторону так, чтобы центр профиля луча и апертура были концентрическими. С помощью программного обеспечения камеры выберите интересующую область, чтобы разрешить наименьшую область считывания камеры, охватывающую оба канала, и запишите эти координаты.

На этом этапе запишите один снимок для представления профиля считывающего луча. Затем заблокируйте считывающий лазер, закрыв первый затвор и открыв второй затвор. Для того чтобы начать измерение профиля активационного пучка спроецируют активационный лазер на образец, при необходимости используют коэффициент умножения электрона менее 100 и регулируют первое дихроичное зеркало до тех пор, пока луч не будет центрирован в каждом поле зрения.

Затем запишите снимок профиля луча активации, чтобы начать получение многоцветных изображений ладони F. Исключите все освещение в комнате. Затем спроецируйте ртутную лампу через откидное крепление на трансфицированные элементы и замените куб фильтра на тот, который содержит соответствующую длину волны возбуждения предварительного фотопереключателя. Государство.

После того, как ячейка выбрана, переместите откидное крепление вниз, чтобы позволить лазерам пройти в микроскоп, замените фильтровальную турель на ту, которая содержит соответствующее дихроичное зеркало для визуализации, как описано в прилагаемом текстовом протоколе. Затем спроецируйте это изображение на камеру, чтобы отличить трансфицированные клетки от фоновой флуоресценции и подтвердить, что молекулы фотобельны. Кратковременно подсветите образец с небольшой мощностью менее 10 мкВт от активационного лазера.

Затем подготовьте программное обеспечение камеры для регистрации кинетических последовательностей, установив игру умножения электронов на 200 и желаемое количество кадров в диапазоне от пяти до 10 000. Также установите выдержку в диапазоне от 10 до 30 миллисекунд. Затем заблокируйте луч активации, разблокируйте луч считывания и спроецируйте изображение подсвеченной ячейки на камеру.

Выберите фокальную плоскость рядом с нижней клеточной мембраной, смещая фокус вниз до тех пор, пока отдельные молекулы не перестанут быть видимыми. Затем постепенно перемещайте фокус вверх, пока молекулы не станут впервые видимыми. Теперь разблокируйте активационный луч и осветите образец с интенсивностью менее одного ватта на квадратный сантиметр.

Начните получать эти данные с помощью программного обеспечения камеры, поддерживая плотность от 0,1 до одной видимой фотомолекулы на квадратный микрон, динамически регулируя фильтр нейтральной плотности перед активационным лазером. Для получения флуоресцентной визуализации с полным внутренним отражением установите зеркало пять и объектив один на один предметный столик для перемещения, который следует переместить в сторону сразу за входом в микроскоп. По мере того, как зеркало 5 и объектив 1 перемещаются, лазеры, выходящие из объектива вверх через образец, будут постепенно наклоняться в одну сторону, продолжая перемещать столик до тех пор, пока угол наклона лазеров не достигнет 90 градусов от вертикали.

В этот момент сам возникающий лазер исчезнет, а входящий лазер будет отражен обратно в апертуру, движущуюся антипараллельно входящему лучу и смещенную в сторону. Вы должны увидеть уменьшение фона, когда образец входит в полную флуоресценцию внутреннего отражения после завершения получения изображения, немедленно закройте затвор микроскопа и заблокируйте оба луча. Отключите усиление, умножающее электроны.

Настройте камеру на запись одного кадра и установите максимальный размер области считывания камеры. Наконец, заблокируйте один канал, поместив карту над F три или F четыре с фильтром длинных частот, установленным на лампе микроскопа. Подсветите образец и спроецируйте это изображение на камеру.

Запишите снимок клетки, чтобы представить всю ячейку в проходящем свете. Здесь показан пример получения двухцветной F-ладонью трехцветной клетки NIH с тремя Т-три-клетками, экспрессирующими как гемагглютинин DENDRA, так и актин PAM Cherry. Передаваемый канал слева содержит более длинные волны, чем отраженный канал справа.

Здесь показаны снимки из тех же двух цветных снимков F OM после фона, вычитания и преобразования для наложения левого и правого каналов. Отдельные молекулы могут быть идентифицированы и локализованы. Некоторые молекулы кажутся ярче в проходящем канале, а некоторые имеют более равномерное распределение излучения между двумя каналами.

Это указывает на разницу в спектрах излучения между вишней PAM и DENDRA соответственно и используется в анализе для идентификации этих двух видов. Показанная здесь гистограмма показывает отношение интенсивности красного канала пропускания, деленное на общую интенсивность для всех локализованных молекул после применения допусков. Пиксели отображаются белым цветом на левом нижнем изображении и красными на окончательном объединенном изображении, показанном в правом нижнем углу, где пиксели в зеленой области отображаются белым цветом в правом верхнем углу и зелеными на окончательном объединенном изображении, показанном в правом нижнем углу.

Пороговые уровни, которые выбираются при рендеринге, сильно влияют на степень шума и появление колокализации. Показывать. Вот три различных варианта рендеринга, которые приводят к различным степеням утечки через самые консервативные пороговые уровни, показаны на двух нижних уровнях. Альфа-гистограммы цвета F ладони лучше всего интерпретировать, когда на изображении есть два заметных пика.

В то время как гистограмма слева является хорошим кандидатом для дальнейшего анализа, изображения, полученные на основе двух других гистограмм, будет гораздо сложнее интерпретировать. Такие методы, как полное внутреннее отражение, микроскопия и визуализация живых клеток, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как белки организованы на наноуровне в живых клеточных мембранах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как настроить собственный микроскоп FAR и использовать его для сбора данных.

Не забывайте, что работа с лазерами может быть чрезвычайно опасной, и перед попыткой этой процедуры необходимо пройти обучение технике безопасности.