Сравнительный анализ структуры РНК зарождающихся и зрелых транскриптов у Saccharomyces cerevisiae

Мы изучали обработку котранскрипционной РНК, включая то, как зарождающаяся РНК складывается при возникновении из РНК-полимеразы, которая её синтезирует. До этого метода мы не могли отслеживать, как РНК складывается во время синтеза, и это мешало нашим исследованиям. Таким образом, этот новый метод преодолевает эти пробелы.

CoSTseq был разработан для изучения зарождающегося сворачивания РНК у дрожжей. Он особенно эффективен для анализа высокообильных РНК. Для начала инкуляция штама Saccharomyces cerevisiae BY4741 в 50 миллилитров среды YPAD и инкубировать при 30 градусах Цельсия с встряхиванием при 200 оборотах в минуту, пока культура не достигнет фазы среднего логарифма.

Соберите примерно три миллилитра культуры дрожжей, соответствующую 1,8 единицам оптической плотности, и центрифугуйте при температуре 2 500 x g в течение трёх минут при 4 градусах Цельсия с использованием предварительно охлаждённой центрифуги. Выбросьте супернатант в контейнер для отходов. Повторно суспензируйте гранулу в 10 миллилитрах холодного PBS и снова центрифугуйте при 2 500 г в течение трёх минут при 4 градусах Цельсия.

Удалите супернатант и держите дрожжевые гранулы на льду. Аккуратно восстановите дрожжевые гранулы в 10 миллилитрах холодного 0,5% саркозила, не создавая пузырей. Инкубировать восстановленные дрожжи на льде в течение 20 минут для обеспечения проникновения, затем пеллетировать клетки при 400 x g в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия и повторно взвешивать проницаемые дрожжевые клетки в 100 микролитрах безнуклеазной воды с помощью пипетки P-1000.

Приготовьте рабочий раствор транскрипционного буфера 2,5 раз с свежим добавлением дитиотрейтола пять миллимоляров и предварительно нагрейте буфер для зондирования структуры 2,5 раза до 30 градусов Цельсия. В чистую двухмиллилитровую трубку добавьте все необходимые компоненты реакции и тщательно перемешайте. Затем добавьте 100 микролитров подготовленных дрожжевых клеток в реакционную трубку и инкубируете их в термомиксере, настроенном на 30 градусов Цельсия, встряхивая при 500 оборотах в минуту в течение двух минут.

Затем быстро добавьте 200 микролитров предварительно нагретого буфера для зондирования структуры 2,5X и одновременно 25 микролитров реагента диметилсульфата. Аккуратно закрутите трубку двумя импульсами и поместите её обратно в инкубатор, установив на 30 градусов Цельсия и 500 оборотов в минуту. Продолжайте инкубировать на термомиксере в течение четырёх минут, с интервалом 30 секунд между образцами.

Заранее подготовьте буферы для стопа и мойки и поставьте их на лёд до использования. Остановите метилирование диметилсульфата, добавив в реакционную трубку один миллилитр стоп-буфера. Теперь центрифугуйте образцы, помеченные диметилсульфатом, при 3 500 x g в течение пяти минут в предварительно охлаждённой центрифуге.

После открутки выбросьте супернатант в соответствующий контейнер для отходов. Добавьте в пеллет один миллилитр охлаждённого буфера для стирки и снова суспенгируйте. Повторите центрифугирование при 3 500 г в течение пяти минут.

Немедленно приступайте к извлечению РНК и не замораживайте дрожжевые гранулы. Ресуспензировать дрожжевую гранулу с маркировкой диметилсульфата в 600 микролитрах буфера лиза РНК, а затем переместить суспензию в трубку с 40 микролитрами 20% натрия додецилсульфата. Инкубировать образец при 65 градусах Цельсия в течение 30 секунд, при встряхивании при 950 оборотах в минуту.

Далее проводите экстракцию РНК фенол-хлороформом по стандартной процедуре. Вихрь магнитные шарики стрептавидина и перенеси 44 микролитра шариков в новую пробирку для каждого образца общей РНК 80 микрограммов. Положите магнитные шарики на магнитную стойку, пока они не оседут.

После снятия буфера для хранения подвесьте шарики в один миллилитр предварительного буфера А. Теперь инкубируйте подвеску две минуты при комнатной температуре, затем намагничисьте и удалите супернатант. После стирки подвесьте бусины в 88 микролитрах 2X буфера для связывания. Пересадите 80 микролитров суспензии в стерильную трубку объемом 1,5 миллилитра с 80 микрограммами образца биотинилированной РНК в 80 микролитрах.

Покрутите смесь для проб шарика на ротаторе 20 минут при комнатной температуре. Затем поместите трубку на магнитную стойку, чтобы собрать поток с зрелой РНК и сохранить её для осадки для проведения поли-А выбора зрелых РНК с помощью рабочего процесса DMS-MaPseq. Затем дважды прополосните зарождающийся РНК-комплекс 500 микролитрами буфера с высоким содержанием соли.

Затем один раз промываю 500 микролитров 1X-буфера для связывания, а затем последний раз 500 микролитров низкосолёного буфера. Теперь добавьте 300 микролитров РНК-реагента в комплекс бусины=зарождающейся РНК, тщательно ресуспендируйте и инкубуйте на термомиксере в течение пяти минут при 60 градусах Цельсия. Далее добавьте 60 микролитров хлороформа, вооружите вихрь и инкубируем три минуты при комнатной температуре.

Центрифугуйте образец при 14 000 x g в течение пяти минут в предохлаждённой центрифуга. В завершение пересадите верхнюю водную фазу примерно 180 микролитров в новую сборную трубку. Отбросьте оставшуюся органическую фазу, оставив бусины и остаточный водный раствор.

После очистки зарождающейся РНК выполните обратную транскрипцию с переключением шаблонов, переключите 5'-адаптер и выберите библиотеки для секвенирования. Визуализация тестовых ПЦР-продуктов на геле 1%агарозы выявила минимальное образование праймерного димера и характерный размаз около 300 пар оснований для секвенирования ко-транскрипционного отслеживания структуры или библиотек CoSTseq и DMS-MaPseq. Электроферограмма для первого образца CoSTseq подтвердила распределение размера библиотеки с пиком около 285 пар оснований.

Выравнивание мРНК по чтению ASC1 показало, что библиотека CoSTseq включает покрытие через интрон, что подтверждает, что РНК находится в зарождающейся стадии. В то время как библиотека DMS-MaPseq не имела покрытия интронов, что указывает на зрелость РНК. Транскрипционная матрица сворачивания 18S пре-рРНК показала, что реактивность DMS резко меняется по мере прогрессирования РНК-полимеразы с позиции 790 на 811 вдоль локуса рДНК.

Анализ реактивности DMS мРНК ADH1 показал схожие профили между зарождающейся и зрелой формами, что указывает на области структурной стабильности. В отличие от этого, мРНК SSA2 демонстрировала участки с различной реактивностью DMS между зарождающейся и зрелой формами, что указывает на структурные изменения в процессе созревания. С помощью CoSTseq исследователи могут in vivo определить зарождающиеся вторичные структуры РНК и расположение РНК-полимеразы вдоль транскриптов РНК.

CoSTseq имеет срочные шаги, использует токсичные химикаты. Лучше обрабатывать не более двух образцов одновременно. Из общего количества РНК, полученной из CoSTseq, небиотинилированные РНК могут использоваться для параллельного зондирования зрелой структуры с использованием традиционного DMS-MaPseq.