Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы познакомить студентов бакалавриата с технологией микрочипов путем изучения различий в экспрессии дрожжей, подвергающихся окислительному стрессу. Это достигается путем выделения общей РНК из культур дрожжей, обработанных перекисью водорода, и необработанных контрольных культур. Вторым этапом процедуры является генерация и очистка CDNA из этих образцов РНК.

Затем CDNA используется для получения меченого биотином CRNA с помощью транскрипции in vitro. Заключительным этапом процедуры является фрагментация меченных биотином CRNA для гибридизации с чипами гена дрожжей AFI-метрики. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают различия в экспрессии в двух образцах дрожжей и с помощью биоинформатики демонстрируют возможности анализа микрочипов студентам бакалавриата.

У команды Vermont Genetics Network Outreach впервые появилась идея этого метода, когда им было поручено предоставить микролучевую технологию студентам естественных наук по всему штату Вермонт, чтобы улучшить их научное образование. На сегодняшний день этот метод был внедрен в несколько центров в восьми колледжах бакалавриата по всему штату. Таким образом, основное преимущество использования микролучей в учебных модулях заключается в том, что это дает нам возможность обучать группу людей методам общей молекулярной биологии, которые используются каждый день в лаборатории.

И мы также можем использовать это для обучения студентов и преподавателей, а также наших групп. У нас есть студенты и преподаватели, которые работают вместе над одним и тем же проектом. Они изучают определенные техники, которые требуют большой тонкости, например, работу с РНК, что является непростой задачей.

Они учатся осаждать ДНК с помощью реагентов для визуализации. Они действительно могут использовать методы, с которыми они столкнутся в аспирантуре или в повседневных лабораториях молекулярной биологии. Хотя этот метод подходит для получения информации об окислительном стрессе и дрожжах, он, безусловно, применим к другим модельным организмам и другим биологическим системам, на которые вы, возможно, захотите обратить внимание.

Экспрессия генов изменяется независимо от того, связаны ли они с изменениями в развитии, токсинами окружающей среды, конкретными заболеваниями и многим другим. Чтобы изучить различия в экспрессии дрожжей, подвергающихся окислительному стрессу, сначала выделяют общую РНК из двух культур дрожжей методом ферментативного лизиса. Одну культуру подвергали окислительному стрессу путем часовой обработки 0,5 миллимолярной перекисью водорода в буферизованном физрастворе Хэнка, в то время как другую культуру обрабатывали только HBSS в качестве контроля.

Начните с маркировки двух пробирок для микроцентрифуг объемом 1,7 миллилитров соответствующей идентификационной информацией. В каждую пробирку переложите по 1,5 миллилитров соответствующей дрожжевой культуры. Центрифугируйте пробирки при давлении 5 000 G в течение двух минут при комнатной температуре.

После центрифугирования с помощью микропипетки осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулу. Прежде чем продолжить процедуру, убедитесь, что гранула достаточно большая. Если гранула слишком мала, добавьте 1,5 миллилитров культуры в ту же пробирку, где находится гранула, а затем центрифугируйте для получения более крупной гранулы.

Выбросьте надосадочную жидкость с помощью микропипетки, удалив как можно больше жидкости из дрожжевой гранулы. Затем добавьте 100 микролитров буфера SG и 30 микролитров раствора лиазы в вихрь дрожжевых гранул для перемешивания. Инкубируйте обе трубки в течение 30 минут при комнатной температуре во время инкубации.

Осторожно поворачивайте каждую пробирку каждые 10 минут, чтобы получить пластины. Одним из самых важных шагов при проведении сферопокрытия дрожжей является уверенность в том, что вы действительно создали стопроцентный сферопласт после обработки. Это означает, что не все литические ферменты одинаковы.

Таким образом, вы должны убедиться, что хороший литический фермент дает вам хорошее сферопокрытие, что означает, что вы должны взять эти образцы, поместить их на предметное стекло микроскопа и проверить под микроскопом, добавив 0,1% SDS, чтобы убедиться, что у вас действительно есть образование протопластов. Чтобы наблюдать полное покрытие сферы, нанесите 10 микролитров образца дрожжей на предметное стекло микроскопа, исследуя образец под микроскопом с концентрацией 0,1% SDS, чтобы вызвать набухание дрожжевых клеток и образование идеальных сфер или сфероидов. Важно отметить, что почковающиеся клетки также образуют S. spheroids.

Если наблюдается частичное покрытие сферы, рекомендуется расширенная обработка ламазой. Как только будет подтверждено полное покрытие сферо на уровне 350 микролитров буфера BRLT на каждую пробирку, затем добавьте 250 микролитров 100% этанола. Убедитесь, что тюбик плотно закрыт, удерживая крышку закрытой, и энергично делайте вихри в течение одной минуты.

Этой процедурой будут заниматься выведение плат Сферо. После этого используйте колонки R и easy Z spin для сбора и очистки РНК из двух культур. Наконец, оцените качество экстрагированной РНК с использованием 1,2%-ного сборного геля aros для электрофореза с целью получения CRNA, меченной биотином.

Общая РНК, выделенная из дрожжевых клеток, сначала используется для синтеза CD NA методом обратной транскрипции. После генерации CD NA подготовьте пробирки с фазовой блокировкой геля для использования в центрифуге с фазовой синхронизацией CD NA на полной скорости в течение одной минуты, чтобы убедиться, что гель находится на дне пробирки. Не используйте вихревые пробирки с фазовым замком для осаждения 162 микролитров пипетки CD NA нижнего слоя трис-буферного фенилхлороформа pH 8,0, изоамилового спирта или смеси PCI и добавляйте к содержимому 162 микролитра второй цепи, реакционной трубке синтеза CD NA равные объемы водных и органических смесей, необходимых для этой стадии.

Вортексом в течение пяти секунд перемешайте содержимое. Затем с помощью микропипетки перенесите всю смесь CD N-A-P-C-I в пробирку с фазовой блокировкой. Не переворачивайте центрифугу с фазовой блокировкой в гелевой пробирке на полной скорости в течение двух минут.

Затем с помощью микропипетки перенесите верхний слой из пробирки с фазовым замком геля в новую пробирку объемом 1,7 миллилитра. Постарайтесь собрать как можно больше слоя. Добавьте в пробирку микроцентрифуги объемом 1,7 миллилитра, 405 микролитров 100% этанола, 80 микролитров ацетата аммония и один микролитр вихря гранулированной краски.

Ненадолго поместите пробирку в центрифугу шарниром пробирки наружу и центрифугируйте на полной скорости в течение 20 минут. При комнатной температуре, когда центрифугирование будет завершено, осторожно извлеките пробирку из центрифуги, стараясь не повредить гранулу CD NA. Пеллетка должна быть розовой из-за пеллетной краски и примерно размером с крупинку соли.

А со стороны трубки под шарниром поместите гранулу CD NA на лед и сразу приступайте к очистке гранулы. Чтобы начать процедуру очистки гранулы CD NA, с помощью микропипетки P 1000 осторожно удалите всю надосадочную жидкость из пробирки. Будьте осторожны, чтобы не потревожить гранулы.

Это ваш образец на 500 микролитров холодного, 80% этанола на пробирку. Аккуратно закройте трубку крышкой и медленно переверните ее несколько раз. Внимательно следите за гранулой, чтобы убедиться, что она не отсоединилась от боковой стороны трубки.

Если гранула отсоединилась, вы можете вернуть ее обратно на дно пробирки, либо поместив пробирку обратно в решетку и дав ей осесть на дно, либо центрифугируя пробирку на полной скорости в течение 15 секунд. Затем с помощью микропипетки P 1000 осторожно удалите этанол, не потревожив гранулы. Наклоните трубку так, чтобы из нее можно было удалить как можно больше жидкости.

Добавьте новую Eloqua из холода, 80% этанола, закройте пробирку крышкой и медленно переверните ее несколько раз. После удаления всего этанола возможно с помощью микропипетки P 1000. Центрифугируйте пробирку на полной скорости в течение пяти секунд.

Затем с помощью микропипетки P 10 удалите последние несколько микролитров этанола, не повреждая гранулы. Поместите открытую пробирку в сушильную коробку на 10-20 минут, чтобы выпарить оставшийся этанол. Гранулы легко потеряются, как только они высохнут, поэтому будьте осторожны, обращайтесь с тюбиком осторожно и закрывайте крышку.

Когда сушка будет завершена, визуализируйте высушенную гранулу, чтобы убедиться, что она присутствует в пробирке. Наконец, суспендируйте высушенную гранулу в 22 микролитрах воды, свободной от РНК, и положите пробирку на лед. Затем эта КДНК используется для получения меченой биотином CRNA путем транскрипции in vitro с использованием набора Enzo BioArray.

После того, как меченый биотином CRNA был очищен и количественно определен, он фрагментируется для подготовки мишени. После того, как CDNA получена, мы используем стандартную методологию транскрипции in vitro для получения биотинилированной CRNA. CRNA должна пройти через фрагментацию, прежде чем ее можно будет нанести на микрочип.

Чтобы начать эту процедуру, перенесите количество, эквивалентное пяти микрограммам CRNA, в маркированную 0,5-миллилитровую ПЦР-пробирку. Добавьте достаточное количество свободной РНК воды, чтобы довести общий объем до 16 микролитров, а затем добавьте в пробирку четыре микролитра из пяти x фрагментационного буфера. Общий объем в тюбике должен составлять 20 микролитров.

Перебейте пробирку и центрифугу на 10 секунд. Затем инкубируйте трубку при температуре 94 градуса Цельсия в течение 30 минут. В термоамплификаторе положите трубку на лед после инкубации.

Фрагментированные и нефрагментированные CRNA из каждого образца затем оцениваются с помощью электрофореза с использованием 1,2%-ного сборного геля AROS. Когда прогон завершен, гель визуализируется на транслюминаторе и получается изображение. Конечный продукт синтеза гибридизуется с чипами генов атричных дрожжей, и здесь представлены репрезентативные результаты анализа микрочипов.

Этот первый рисунок представляет собой пример отсканированного изображения чипа гена дрожжей atrics, сгенерированного операционным программным обеспечением atrics gene chip. Это двумерная диаграмма рассеяния всех генетических транскриптов, около 6 700 генов, сравнивающих данные контрольных и обработанных дрожжей. Каждая точка представляет собой один ген.

Гены, окрашенные в фиолетовый цвет, указывают на гены, которые экспрессируются дифференциально, в то время как гены, окрашенные в красный цвет, не экспрессируются. В этом примере большинство дифференциально экспрессируемых генов участвуют в контроле клеточного цикла, как указано в их описаниях. Эта блок-схема из базы данных для аннотирования, визуализации и интегрированного открытия иллюстрирует дифференциально экспрессируемые гены в затронутом биологическом пути.

Гены, обозначенные красной звездочкой, указывают на подавленные гены в миотическом пути. Наконец, здесь показаны репрезентативные результаты построения графика вулкана, созданного с помощью программного обеспечения для просеивания генов геовидов. Контрольные и обработанные образцы сравнивали с отсечкой P-значения, равной 0,05, и 1,5-кратной отсечкой изменения экспрессии.

Мы выбрали дрожжи, потому что дрожжи легко и быстро выращиваются, но мы также поняли, что самая важная часть работы с дрожжами — это создание достойного сферопокрытия. Одна из вещей, которую мы не хотим делать в микрочипах, это проводить неполное переваривание и на самом деле только те клетки сферопласта, которые находятся в фазе G 1 или G 2 M. Затем вы проводите эксперимент с микрочипом на дрожжах, которые находятся в определенной фазе репликации.

Еще один сложный момент, который мы пытаемся донести до сознания в этом упражнении, заключается в том, что гранулирование CD NA люди говорят каждый день, но это не обязательно легко. В нашем модуле мы использовали специализированные пробирки и реагенты для визуализации. Таким образом, мы можем на самом деле вращать вниз ДНК, и вы можете визуализировать апелляцию, что облегчает задачу как студентам, так и преподавателям.

Так что это может быть использовано на всех этапах работы ДНК и РНК после ее развития. Этот модуль действительно проложил путь для преподавателей институтов бакалавриата к исследованию, возможно, к изучению других модельных организмов или других схем лечения, которые могут быть совместимы с существующими учебными программами или, возможно, их собственными исследовательскими интересами. И чтобы дать вам пример некоторых изменений, которые были сделаны, один сайт рассматривал влияние обработки гербицидами на дрожжи, или другой сайт рассматривал обработку LAMP IDE на дрожжах, в то время как другой сайт рассматривал изменения в развитии в клеточной линии млекопитающих, которые их особенно интересовали.

И, наконец, на другом сайте рассматривалось влияние дифференциальных источников света на арабидопсис или растения. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как организовать микролучевой эксперимент со студентами бакалавриата, включая выделение общей РНК из дрожжей, генерацию CDNA и фрагментацию биотина, меченного CRNA. Практический опыт работы с такими технологиями высокого уровня помогает укрепить и укрепить высшее научное образование.