Метод взаимодействия хроматина с ДНК с РНК

Мы разработали метод взаимодействия хроматина ДНК-ДНК, ассоциированный с РНК, или метод RDD, для картирования контакта хроматина, организованного определёнными молекулами РНК. RDD надёжно картирует РНК-специфические хроматиновые полоски и дальнее взаимодействие между эндогенными и экзогенными РНК. Для начала ресуспензировать проницаемые ядерные гранулы, полученные из двойных перекрёстно-сшитых клеток Drosophila S2, в 15 миллилитрах буфера лизиса 0,1%FA, содержащего Triton X-100.

Aliquot 1,5 миллилитра ядерной суспензии в 14-миллилитровую пробирку с круглым дном, избегая образования пузырьков. Соникизуйте подвеску с амплитудой 38% в течение 4,5 минут с 30-секундными циклами включения и 30-секундного выключения. Соберите соникированный хроматин в 15-миллилитровую трубку и центрифугуйте при 3 200 г в течение 20 минут при комнатной температуре.

Перенесите примерно 13 миллилитров супернатанта в новую 15-миллилитровую трубку. Теперь добавьте 100 микролитров подготовленных бусинок стрептавидина C1 в пробирку с соникированным хроматином и покрутите 20 минут при комнатной температуре. Затем поместите трубку на магнитную стойку на одну минуту и перенесите супернатант с предварительно очищенным хроматином в новую 50-миллилитровую трубку.

Храните 10-микролитровый аликвот при минус 20 градусах Цельсия для анализа. Инкубировать 26 миллилитров свежеприготовленного буфера для гибридизации с 13 миллилитрами предварительно очищенного хроматина на ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре. Далее аликвотируйте гибридизационную смесь в три 15-миллилитровых пробирки и добавляйте шесть микролитров 100-микромолярных биотинилированных зондов в каждый образец.

После запечатывания крышек трубок пленкой поворачите трубки при 37 градусах Цельсия на ночь. После блокировки бусинок стрептавидина C1 удалите блокирующий буфер и снова подвесьте шарики в 400 микролитрах буфера гибридизации. Теперь добавьте буферы стрептавидина C1, обработанные блокирующим буфером, к соответствующему гибридизированному хроматину, подготовленному заранее.

Вращайте смесь 2,5 часа при комнатной температуре. После удаления супернатанта и переноса шариков в трубку объёмом 1,5 миллилитра, промыйте шарики пять раз с помощью 800 микролитров буфера для мойки, а затем два раза с буфером TE. После окончательной промывки сбросьте супернатант и снова суспензируйте шарики в 1 000 микролитров буфера TE, содержащем 1X ингибитор протеазы при комнатной температуре.

Для блокировки незанятых участков на стрептавидиновых C1-шариках, связанных с зонд-хроматиновым комплексом, добавьте 220 микролитров денатурированного IPB в шарики и покрутите трубку при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации промой бусины стрептавидина C1 пять раз с помощью буфера TE. Далее добавьте 693 микролитра конечной смеси для восстановления концов в хроматин на бусинах стрептавидина C1 и хорошо перемешайте.

Затем добавьте семь микролитров ДНК-полимеразы T4. Инкубировать смесь на термомиксере при 800 оборотах в минуту и 12 градусах Цельсия в течение 30 минут. Затем инкубировать образец на миксере при 16 градусах Цельсия в течение 15 минут.

Промой шарики три раза с 800 микролитрами ледяного буфера ChIA-PET, а затем один раз с буфером TE. Затем добавьте 693 микролитра A-хвостовой смеси в хроматин на бусинах стрептавидина C1 и хорошо перемешайте. Далее добавьте семь микролитров фрагмента Кленоу с тремя простыми до пяти простых экзонуклеазы минус.

Инкубировать трубку на миксере при 12 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия в течение 50 минут. Промыйте шарики три раза 800 микролитрами ледяного буфера ChIA-PET, а затем один раз элюсионным буфером с помощью мягкой пипетки. Теперь добавьте 1 390 микролитров смеси для приближения к хроматину на бусинах стрептавидина C1 и инкубируете на миксере комнатной температуры в течение пяти минут.

Добавьте в смесь 10 микролитров ДНК-лигазы T4 и инкубировать с вращением при 20 оборотах в минуту при комнатной температуре в течение пяти минут, затем переключитесь на 12 оборотов в минуту при комнатной температуре в течение 50 минут и продолжите инкубацию при 16 градусах Цельсия ночью. Далее промой шарики три раза 800 микролитрами ледяного буфера ChIA-PET, а затем два раза буфером TE. Для высвобождения хроматина добавьте 480 микролитров буфера элюции LC ChIP к хроматину на шариках стрептавидина C1 и хорошо перемешайте.

Добавьте 20 микролитров 20 миллиграмм на миллилитр протеиназы K для удаления сшивания. Инкубировать трубку на термомиксере при 950 оборотах в минуту и 65 градусах Цельсия за ночь, затем очистить ДНК, лигированную по близости, с помощью реагента фенол:хлороформ:изоамил-спирт. Добавьте все необходимые компоненты для теста маркировки Tn5 в общий объём реакции 50 микролитров в ПЦР-пробирку на льду.

Инкубировать реакцию маркировки при 55 градусах Цельсия в течение 10 минут в термоциклере с крышкой, установленной на 70 градусов Цельсия, а затем держать на 4 градусах Цельсия. Добавьте 50 микролитров буфера элюции ChIP и один микролитр протеиназы K к отмеченной ДНК. Перемешайте раствор и инкубуйте на термомиксере при температуре 65 градусов Цельсия и 900 оборотах в минуту в течение 30 минут.

Очищайте ДНК с помощью комплекта для очистки ДНК и количественно оценивайте ДНК с помощью автоматической системы капиллярного электрофореза. Добавьте всю фрагментированную лигированную ДНК в шарики M280, предварительно заблокированные блокирующим буфером и геномной ДНК, и смешайте суспензию. Покрутите лампу на миксере при комнатной температуре 45 минут.

После короткого вращения поставьте трубку на магнитную стойку и сбросьте супернатант. После процедуры промывания добавьте 30 микролитров буфера элюции в шарики без смешивания. Подготовьте ПЦР-смесь согласно набору для подготовки ДНК-библиотеки.

Перенесите ПЦР-лампы на ПЦР-машину и настройте программу усиления. Наконец, после очистки ПЦР-продукта с помощью магнитных шариков, измерьте 10–30 нанограммов библиотечной ДНК с помощью квантора нуклеиновых кислот для подготовки образца к секвенированию. Звуковые фрагменты хроматина варьировались примерно от 1 000 до 3 000 пар оснований, что свидетельствует об успешной фрагментации.

РНК-ассоциированный хроматин имел диапазон размеров фрагментов примерно от 1 000 до 3 000 пар оснований. Хроматин с меткой Tn5 показал распределение фрагментов, указывающее на эффективность маркировки хроматина. Библиотека секвенирования после амплификации показала распределение размеров фрагментов примерно от 180 до 1000 пар оснований.

После выбора размера фрагменты библиотеки секвенирования преимущественно обогащались примерно в диапазоне от 250 до 600 пар оснований. Взаимодействие ДНК-ДНК с РНК, ассоциированное с РНК, или метод RDD, выявило геномные расположения связывания NC RNA roX2 и 7SK, а также соответствующие удалённые петли взаимодействия хроматина. Данные РНК-полимеразы II ChIA-PET показывают чёткую регуляторную связь между этими НК-РНК и экспрессией генов, при этом пики указывают на силу взаимодействия.

Многомерный анализ был достигнут путём интеграции взаимодействий, связанных с RDD, с картами конформации хроматина по всему геному Hi-C и эпигеномными метками, зарождающейся транскрипцией и данными РНК-полимеразы II ChIA-PET. В этих областях топологически ассоциирующие домены были чётко визуализированы, при этом хроматиновые петли, управляемые РНК, часто располагались на их границах или охватывали несколько таких доменов. Кроме того, были определены регуляторные узлы, ориентированные на РНК.

Метод RDD и якорные взаимодействия хроматина, выявляющие сайты связывания РНК и связанные взаимодействия ДНК в организации 3D-генома. Ключевые учения включают поддержание правильного соотношения зондов, линкеров и хроматинов, а также блокировку неограниченных участков стрептавидина естественным биотином перед полимеразной связкой. Будущие исследования смогут изучить, как РНК динамически связывает хроматиновые взаимодействия между развитием, нарушениями и инфекциями.