Хирургический протокол для большого, закрываемого черепного окна, позволяющего продольные, мультимодальные электрофизиологические записи сети по умолчанию для мыши

Сеть по умолчанию, или DMN, — это ключевая, масштабная сеть, вовлечённая в ряд когнитивных функций и нейропсихиатрических расстройств, таких как депрессия. Изучение сложной динамики DMN на животных моделях даёт бесценное понимание его функции как в здоровых, так и в патологических состояниях. Однако серьёзной проблемой стало проведение стабильных, долгосрочных и масштабных электрофизиологических записей с множества глубоких и распределённых узлов, ДМН, у бодрствующих мышей.

Здесь мы представляем новый двухфазный хирургический протокол, разработанный в лаборатории Ээро Кастрен. Эта техника создаёт большое, прочное и закрываемое окно черепа, позволяющее одновременно проводить повторные продольные записи с более чем 1000 каналов электродов. Это достигается за счёт сочетания поверхностной микроэлектрокортикографии, микро-ECoG, с двумя зондами Neuropixels, что обеспечивает беспрецедентный доступ к сети Default Mode.

Это видео даст пошаговое руководство по этой надёжной хирургической процедуре — от подготовки животных и имплантации головной пластины до создания хронического черепного окна, обеспечивая высококачественный и долгосрочный сбор данных для сетевых нейронаучных исследований. Все представленные процедуры были одобрены Национальным экспериментальным советом Финляндии и соответствуют европейской директиве по защите животных, используемых в научных целях. Фаза 1, подготовка животных и имплантация головного щита.

Для проведения этой процедуры начните с подготовки всех необходимых хирургических материалов и оборудования. Обезболить мышь 4% изофлураном и поддерживать анестезию на уровне 1,5–2,5% с расходом кислорода 0,5 литра в минуту. Сбрийте шерсть с макушки головы и положите животное на контролируемую грелку с внутренним датчиком температуры, откалиброванным так, чтобы поддерживать температуру тела на уровне 37 градусов Цельсия на протяжении всей процедуры.

Наносите глазную мазь карбомер, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Закрепите мышь в стереотаксической раме так, чтобы череп лежал ровно, и введите предоперационные обезболивающие и противовоспалительные препараты с помощью подкожных инъекций — карпрофена, бупренорфина и дексаметазона. Дезинфицируйте выбритое место раствором повидона-йода и введите раствор лидокаина-эпинефрина в качестве местного анестетика под кожу головы.

Сделайте небольшой поперечный разрез в области уха и постепенно увеличивайте разрез, чтобы полностью обнажать верхнюю часть поверхности черепа. Аккуратно очистите открытый череп ацетоном, пока не удаляете весь видимый надственный отдел, чтобы обеспечить прочную адгезию импланта. Используйте тупое круглое лезвие скальпеля, чтобы удалить остатки периостальной и соединительной ткани, которые ацетоновая промывка не смогла полностью устранить.

С помощью стереотаксического устройства отметьте прямоугольную область размером 4 на 7,6 миллиметра на черепе относительно брегмы. Прямоугольник должен простираться на два миллиметра латерально от брегмы с обеих сторон, три миллиметра рострально и 4,6 миллиметра по хвосту. Далее отметьте два участка вставки внутричерепного зонда в правом полушарии.

Отметьте место рострального зонда на 1,66 миллиметра впереди и 1,95 миллиметра латерально от брегмы, а хвостовое зондовое место — на 2,2 миллиметра сзади и 1,9 миллиметра латерально от брегмы. Далее выгравируйте перекрёстный узор на всех открытых костных поверхностях за пределами оконной области хирургическим лезвием с номером 11 и создайте неглубокие, но очерченные бороздки глубиной примерно 0,2–0,4 миллиметра, чтобы создать равномерную сетку примерно один на один миллиметровый квадрат. Создайте тонкий клей-аппликатор, приставив стерильную иглу весом 30 г к кончику ватного тампона и согните иглу в форме буквы V.

Насыпьте цианоакрилатный клей в одноразовую пластиковую весовую лодку и окуните аппликатор в резервуар клея. Нанесите клей на каждую открытую и выгравированную костную поверхность, нанося не более одного слоя на участок, чтобы покрытие было тщательным, но никогда не чрезмерным. Дайте клею высохнуть семь минут, прежде чем приступить.

Для имплантации опорного гнезда выберите место сверления над левым положением мозжечка, чтобы избежать видимых поверхностных сосудов. Просверлите пилотное отверстие пять-десятью секундами с круглым стальным жорном со скоростью 20 000–25 000 выстрелов в минуту, пока отверстие не станет более прозрачным и не откроет светло-розовый оттенок. Вставьте позолоченное опорное гнездо в пилотное отверстие, закрепите его цианоакрилатным клеем и укрепите соединение зубным цементом, который может оправиться ультрафиолетом.

Залечите зубной цемент светодиодной лампой для отверждения на одну минуту. Далее положите небольшое количество зубного цемента, поддающегося ультрафиолету, на вершину открытой ростральной кости и положите наголовную пластину под череп так, чтобы один край опирался на зубные цементные каркасы, отвергнутые вокруг опорного гнезда, а противоположный край — на свежем ростральном цементе. Убедитесь, что наголовье по центру и выровнено.

Укрепите конструкцию, нанеся зубной цемент вокруг основания головной пластины и обведите выгравированную кость и опорное гнездо, пока вокруг периметра будущего черепного окна не сформируется непрерывный, герметичный корпус. В конце концов, затвердевал зубной цемент светодиодной заверждающей ручкой на одну минуту. Когда цемент полностью затвердеет, дайте мыши проснуться после анестезии.

Первый этап теперь завершён. Дайте мыши восстановиться не менее 48 часов, прежде чем перейти к следующему этапу. Фаза 2, хроническое создание окон черепа.

Вторая фаза требует тех же инструментов и лекарств, что и первая, за исключением местного анестетика. Кроме того, для этой фазы требуется стерильная, тонкая мембрана PDMS, холодная искусственная спинномозговая жидкость, хранящаяся на льду, эластомерный силиконовый герметик и индивидуальная 3D-печатная защитная крышка. Не менее чем через 48 часов после первой операции повторно анестезируйте мышь изофлураном, положите её на грелку на стереотаксической раме и введите предоперационные препараты, как в первой фазе, кроме местного анестетика лидокаина-эпинефрина.

Начинайте истончение кости зубной дрелью вдоль прямоугольного контура, отмеченного в Фазе 1, начиная с 25 000 выстрелов в минуту, держа устройство под углом 90 градусов относительно поверхности кости, и выполните один-два чуть более глубоких прохода вдоль краёв прямоугольника, чтобы создать начальную резовую канавку. Просверлите неглубокие канавки в кости и стоматологический цемент рядом с окном черепа в двух координатах установки зонда. Эти борозды служат стойкими визуальными ориентирами, которые остаются видимыми после удаления костного лоскута и используются для повторного перестановки внутричерепных зондов в последующих электрофизиологических сессиях.

Регулярно применяйте ледяную стерильную искусственную спинномозговую жидкость во время сверления, чтобы предотвратить термические повреждения коры и минимизировать кровотечение. Постепенно снижайте скорость сверления до 20 000 выстрелов в минуту по мере истончения кости. Продолжайте сверлить вдоль периметра прямоугольника, пока кость внутри контура не станет примерно на 90% тоньше.

Не просверливайте череп полностью. Переключитесь на тонко изогнутый твердый крюк. Осторожно вставьте кончик под край тонкой кости и проведите крючок по периметру окна, аккуратно отделяя костный лоскут от окружающего черепа и подлежащей ткани.

Аккуратно поднимите успешно отсоединённый костный лоскут с помощью крючка дурой в направлении сзади или вперёд примерно на 35 градусов над поверхностью черепа. Держите приподнятый край щипцами и мягко покачивайтесь влево и вправо, пока пластина полностью не освободится. Аккуратно очищайте открытую область от свернувшейся крови с помощью многократных промываний ледяным ACSF.

Разместите одну стерильную предварительно отлитую мембрану PDMS прямо под дюральную поверхность после того, как кровотечение прекращается. При правильном размере она точно закрывает окно и пассивно прилипает к твердой мозговой мозговой мозгу. Запечатайте краниотомию, нанеся силиконовый герметик.

Заполните каждую щель между зубным цементным корпусом и внутренним краем головной пластины, полностью окружая и перекрывая края мембраны BDMS. Прикрепите на голову специальную 3D-печатную защитную крышку с небольшим количеством цианоакрилатного клея, чтобы защитить окно между сессиями записи. Мышь теперь готова к восстановлению и должна быть перемещена в домашнюю клетку для индивидуального размещения, чтобы предотвратить повреждение импланта.

Успешная операция приводит к появлению прозрачного окна над корой с видимой сосудистой системой и минимальными признаками воспаления или инфекции. Эта прозрачность может сохраняться более 21 дня, что позволяет проводить долгосрочные долгосрочные исследования. Необработанные электрофизиологические сигналы, записанные через хроническое окно, сохраняли высокое качество на протяжении продольной временной шкалы.

Здесь репрезентативные широкополосные микро-ECoG-следы, взятые из задней ретросплениальной сетки, а также одновременные внутричерепные зондовые локальные полевые потенциалы, взятые из поверхностного кортикального канала, показываются рядом в первый день записи и 21 день после этого. Записи 21-го дня демонстрируют сопоставимую амплитуду сигнала, спектральное содержание и отсутствие артефактов движения и шума по сравнению с записями первого дня у того же животного, что подтверждает, что ни хроническое присутствие мембраны PDMS и силиконового уплотнения, ни повторяющиеся дюральные проколы не приводили к заметному ухудшению качества сигнала как поверхности, так и внутричерепного зонда в поверхностных корковых слоях, где деградация должна была проявиться первой. Основной валидацией этого метода является получение стабильных, высококачественных мультимодальных электрофизиологических данных со временем.

Герметичное окно позволяет многократно вставлять зонды для записи из одних и тех же нейронных популяций в течение недель. По всему альфа-диапазону матрицы значений фазового блокировки, вычисленные по каналам вдоль каудального высокоплотного внутричерепного электродного зонда, демонстрируют стабильную функциональную архитектуру между исходным уровнем и сеансом после обработки 21-го дня. Это показывает воспроизводимое повторное вставление в одно и то же кортикальное место, а не формальное отслеживание одних и тех же отдельных нейронов.

Хотя незначительная интерцессионная трансляция шанка исключает одно и то же единичное утверждение, агрегированная ламинарная и региональная структура альфа-диапазонных взаимодействий сохраняется, что подтверждает то, что хроническое окно позволяет проводить продольную выборку одной и той же функциональной цепи. Для прямой проверки того, поддерживает ли хроническое окно воспроизводимое ламинарное таргетирование одних и тех же глубоких структур в разных сессиях, были вычислены карты плотности источников тока или CSD-карты из LFP-каналов зондов. Профили CSD, вызванные стимулом, показывают, что ожидаемые ламинарные сигнатуры источника погружения, включая прелимбическую кору и переднюю поясную область, сохраняются между сессиями.

Наложения ламинарного профиля мощности между двумя сессиями очень схожи на протяжении сессий, при этом корреляция Пирсона составляет 0,81. Различия, наблюдаемые во вторичной моторной коре, вероятно, связаны с различиями в движении между записями. Поскольку график CSD несёт анатомическую информацию, он может предоставлять внутрисессионный нетерминальный отсчёт того, какие области мозга в данный момент отбирает каждый зонд независимо от посмертных окрашиваний тканей.

Воспроизводимость размещения поверхностного микроECoG на протяжении сессий количественно измеряется независимо от внутричерепного показания CSD. Пространственные карты мощности с ограничением полос, вычисленные из микро-ECoG сетки на День 0 и 21, накладываются, а пиксельная корреляция двух отображений вычисляется отдельно для ростральной и каудальной подсеток. Корреляции профиля подсетки остаются высокими, а пространственные штрихкоды двух сессий явно совместно локализуют одни и те же кортикальные горячие точки питания как на ростральной, так и на хвостовой половине массива.

Синусоидальная очередь выравнивания, видимая через полупрозрачную сетку, вместе с выгравированными костными бороздами в координатах вставки зонда, обеспечивает миллиметровую воспроизводимость микро-ECoG расположения на протяжении 21-дневного продольного интервала. Для дальнейшей проверки метода иммуногистохимические окрашивания для GFAP и IBA1 в посмертных срезах мозга были проведены примерно через четыре недели после операции по краниотомии. GFAP экспрессируются астроцитами, которые повышаются при реактивном глиозе, таком как повреждение мозга или воспаление.

IBA1, напротив, экспрессируется микроглией, которая более активна во время нейровоспалительных процессов. Валидационная когорта состояла из животных, у которых была проведена полная двухфазная операция, а черепное окно затем трижды открывалось на 0, 21 и 22 день после операции. Однако в этой когорте не проводилось установка микро-ECoG или внутричерепные зонды.

Окно заново закрывалось между сессиями, как во время электрофизиологической записи. Таким образом, эта когорта выделяет воспалительный вклад хронического окна и повторяющегося воздействия дуральной части от любого повреждения тканей, вызванных зондом. Значимых различий ни в одном из маркеров между контрольной группой без операции и группой, прошедшей операцию, не было выявлено.

Эти репрезентативные микрофотографии не показывают качественных доказательств реактивного глиоза или микроглиальной активации в области непосредственно под окном. Однако наблюдалось небольшое увеличение активации микроглии и астроцитов рядом с траекторией зонда и в полушарии ввода зонда соответственно, что, вероятно, могло быть связано с слишком высокой скоростью ввода внутричерепного зонда. Успешная операция приводит к прозрачному и прозрачному окну над корой с минимальным воспалением.

После хронического периода лечения может возникнуть небольшой отёк мозга. Это можно контролировать с помощью тщательного мониторинга и, при необходимости, введения дополнительных обезболивающих. Для записи просто снимите крышку и герметик, разместите микро-ECoG сетки и нейропиксельные зонды и начните сбор данных от бодрствующего, ведущего себя животного.

В итоге, этот двухфазный хирургический протокол обеспечивает надёжный и высокоэффективный метод создания большого хронического черепного окна у мышей. Ключевые преимущества процедуры — минимальное повреждение твердой мозговой клетки и большое воздействие, которое она обеспечивает, что критически важно для одновременного размещения как поверхностных микро-ECoG-сеток, так и множества глубоких нейропикселей мозга. Этот метод позволяет проводить беспрецедентные продольные исследования электрофизиологической динамики всей сети в DMN и других крупномасштабных схемах.

Это открывает дверь для более глубоких исследований нейронных основ сложных поведенческих проявлений и патофизиологии заболеваний мозга, в конечном итоге способствуя разработке новых терапевтических средств.