Нейтрофилов Изоляция протокола

Протокол выделения нейтрофилов. В ходе этой процедуры лейкоциты будут извлечены из цельной крови, оборудования для отбора проб, центрифуги и флаконов. Вихревой сэр игла и шприц, шприц, фильтр.

Милли-лить марки MX gv 0,22 Микронные материалы. Для разделения нейтрофилов заклинания Хэнка и раствора соли требуются два вида растворов HBSS. HBSS с хлоридом кальция будет использоваться для приготовления раствора с сывороточным альбумином человека.

HBSS без хлорида кальция будет использоваться для суспензии и промывания нейтрофилов. Пожалуйста, будьте особенно осторожны при использовании соответствующего раствора HBSS в этой процедуре. Сывороточный альбумин человека или HSA — это белок в плазме крови, который поддерживает pH и давление SMO.

Не используйте буфер для лизиса бычьей сыворотки в сочетании с эритроцитами. Это изготовлено компанией Roche Diagnostics, среда для изоляции нейтрофилов NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly разделительная среда, защищенная от света и хранящаяся в холодильнике для достижения наилучших результатов. Все реагенты должны быть комнатной температуры на момент использования.

Достаньте реактивы из холодильника за час до эксперимента. Приготовьте раствор H-B-S-S-H-S-A для разделения нейтрофилов. Пипетка HBSS с хлоридом кальция в флакон.

Наберите HSA в шприц. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Извлеките иглу шприца и замените ее фильтром.

Введите HSA через фильтр во флакон HBSS vortex two mix, когда у вас будут готовы другие материалы, и при комнатной температуре получите около 15 миллилитров цельной крови. Это даст от 10 до 15 миллилитров от 10 до восьми нейтрофилов. Донор не должен употреблять алкоголь или безрецептурные препараты в течение 24 часов до сдачи образца крови.

Это может нарушить процесс разделения. Цельную кровь можно антикоагулянтировать цитратом ЭДТА или гепарином путем добавления девяти частей крови к одной части К, трех цитратов натрия ЭДТА или гепарина в соответствии с инструкциями производителя. В этой процедуре будут описаны следующие шаги.

Отделите и удалите плазму и моноциты. Отделить и получить нейтрофильный слой, лизирующий эритроциты, свободную суспензию нейтрофилов сначала разделить. Получение нейтрофилов в слое NIM.

Соберите пять миллилитров изолирующей среды в центрифужную пробирку. Размещение изолирующего материала ниже в пробирке позволяет ему действовать как фильтр, так как центрифуга будет осторожно пропускать кровь через него. Нанесите пять миллилитров крови на NIM для чистого разделения.

Будьте очень осторожны, чтобы не перепутать растворы. Выполняйте этот шаг медленно и осторожно, расположив наконечник пипетки близко к поверхности разрешающей среды, чтобы предотвратить смешивание центрифуги. Раствор при 500 RCF в течение 35 минут.

При температуре от 20 до 25 градусов по Цельсию кровь должна разделиться на шесть отдельных полос. Эти шесть полос — это моноциты плазмы, изолирующие среды, нейтрофилы, больше изолирующих сред и гранула эритроцитов внизу. Если эти шесть полос не являются четкими и отчетливыми, процесс разделения не был чистым и его необходимо будет повторить.

Распространенными причинами плохого расставания являются старый донор среды изоляции, употреблявший алкоголь в течение последних 72 часов, или донор, употреблявший другие лекарства, такие как тайленол или аспирин. Осторожно удалите и выбросьте моноциты плазмы и изолирующие среды. Поместите эти слои в герметичную пробирку и осторожно выбросьте пипетку: удалите слой нейтрофилов и все изоляционные среды под нейтрофилами в чистый файл центрифуги, чтобы извлечь как можно больше нейтрофилов.

Часто проще всего также включить некоторые изоляционные среды из нижестоящего слоя. Не тревожьте поддон внизу. Второе объявление, уточнение слоя нейтрофилов.

Разведите раствор нейтрофилов до 10 миллилитров с HBSS без кальция. Переверните трубку несколько раз, чтобы подвесить клетки центрифуги. Раствор нейтрофилов.

350 RCF в течение 10 минут. При температуре от 20 до 25 градусов Цельсия на дне пробирки должна присутствовать красная гранула, содержащая нейтрофилы и остаточные эритроциты. Удалите наднатин с помощью пипетки.

Будьте осторожны, чтобы не потревожить дробину на дне. Лизис эритроцитов.

Теперь красные кровяные тельца в образце должны быть разрушены путем лизиса. Чтобы лизировать остаточные эритроциты, добавьте два миллилитра буфера для лизиса эритроцитов в пробирку для реанимации. Подвесьте гранулу вихревой во флаконе при установке трех-четырех.

Не увеличивайте настройку вихря выше четырех, так как это может привести к активации нейтрофилов. Может потребоваться сделать вихрь вихрем в течение нескольких секунд или импульсировать вихрь, чтобы растворить нёбо. Центрифугируйте раствор для лизиса при 250 RCF в течение пяти минут.

Используйте опцию плавного пуска, чтобы свести к минимуму повреждение образца. Удалите наднатин с помощью пипетки. Повторите процесс лизирования.

При необходимости выпустите суспензию нейтрофилов, добавьте в каждую трубку по 500 микролитров HBSS без кальция. Вихревую гранулу при настройке три-четыре, разбавить до 10 миллилитров с помощью HPSS без кальциевой центрифуги. Нейтрофилы при 250 RCF в течение пяти минут отсасывают снат и отбрасывают его.

Повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах HBSS с раствором HSA, два раза по 10 на шесть. Обычно собираются нейтрофилы на миллилитр.