Нейтрофилов Изоляция протокола
23 июля 2008 г.
Нейтрофилы являются одними из первых клеток, чтобы прибыть на место воспалительного иммунного ответа, а также их функции и механизмы хорошо изучены в лабораторных условиях. Мы демонстрируем стандартный градиент плотности метод разделения, чтобы изолировать нейтрофилов человека из цельной крови с использованием коммерчески доступных раздела сред.
Протокол выделения нейтрофилов. В ходе этой процедуры лейкоциты будут извлечены из цельной крови, оборудования для отбора проб, центрифуги и флаконов. Вихревой сэр игла и шприц, шприц, фильтр.
Милли-лить марки MX gv 0,22 Микронные материалы. Для разделения нейтрофилов заклинания Хэнка и раствора соли требуются два вида растворов HBSS. HBSS с хлоридом кальция будет использоваться для приготовления раствора с сывороточным альбумином человека.
HBSS без хлорида кальция будет использоваться для суспензии и промывания нейтрофилов. Пожалуйста, будьте особенно осторожны при использовании соответствующего раствора HBSS в этой процедуре. Сывороточный альбумин человека или HSA — это белок в плазме крови, который поддерживает pH и давление SMO.
Не используйте буфер для лизиса бычьей сыворотки в сочетании с эритроцитами. Это изготовлено компанией Roche Diagnostics, среда для изоляции нейтрофилов NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly разделительная среда, защищенная от света и хранящаяся в холодильнике для достижения наилучших результатов. Все реагенты должны быть комнатной температуры на момент использования.
Достаньте реактивы из холодильника за час до эксперимента. Приготовьте раствор H-B-S-S-H-S-A для разделения нейтрофилов. Пипетка HBSS с хлоридом кальция в флакон.
Наберите HSA в шприц. Избегайте попадания пузырьков воздуха. Извлеките иглу шприца и замените ее фильтром.
Введите HSA через фильтр во флакон HBSS vortex two mix, когда у вас будут готовы другие материалы, и при комнатной температуре получите около 15 миллилитров цельной крови. Это даст от 10 до 15 миллилитров от 10 до восьми нейтрофилов. Донор не должен употреблять алкоголь или безрецептурные препараты в течение 24 часов до сдачи образца крови.
Это может нарушить процесс разделения. Цельную кровь можно антикоагулянтировать цитратом ЭДТА или гепарином путем добавления девяти частей крови к одной части К, трех цитратов натрия ЭДТА или гепарина в соответствии с инструкциями производителя. В этой процедуре будут описаны следующие шаги.
Отделите и удалите плазму и моноциты. Отделить и получить нейтрофильный слой, лизирующий эритроциты, свободную суспензию нейтрофилов сначала разделить. Получение нейтрофилов в слое NIM.
Соберите пять миллилитров изолирующей среды в центрифужную пробирку. Размещение изолирующего материала ниже в пробирке позволяет ему действовать как фильтр, так как центрифуга будет осторожно пропускать кровь через него. Нанесите пять миллилитров крови на NIM для чистого разделения.
Будьте очень осторожны, чтобы не перепутать растворы. Выполняйте этот шаг медленно и осторожно, расположив наконечник пипетки близко к поверхности разрешающей среды, чтобы предотвратить смешивание центрифуги. Раствор при 500 RCF в течение 35 минут.
При температуре от 20 до 25 градусов по Цельсию кровь должна разделиться на шесть отдельных полос. Эти шесть полос — это моноциты плазмы, изолирующие среды, нейтрофилы, больше изолирующих сред и гранула эритроцитов внизу. Если эти шесть полос не являются четкими и отчетливыми, процесс разделения не был чистым и его необходимо будет повторить.
Распространенными причинами плохого расставания являются старый донор среды изоляции, употреблявший алкоголь в течение последних 72 часов, или донор, употреблявший другие лекарства, такие как тайленол или аспирин. Осторожно удалите и выбросьте моноциты плазмы и изолирующие среды. Поместите эти слои в герметичную пробирку и осторожно выбросьте пипетку: удалите слой нейтрофилов и все изоляционные среды под нейтрофилами в чистый файл центрифуги, чтобы извлечь как можно больше нейтрофилов.
Часто проще всего также включить некоторые изоляционные среды из нижестоящего слоя. Не тревожьте поддон внизу. Второе объявление, уточнение слоя нейтрофилов.
Разведите раствор нейтрофилов до 10 миллилитров с HBSS без кальция. Переверните трубку несколько раз, чтобы подвесить клетки центрифуги. Раствор нейтрофилов.
350 RCF в течение 10 минут. При температуре от 20 до 25 градусов Цельсия на дне пробирки должна присутствовать красная гранула, содержащая нейтрофилы и остаточные эритроциты. Удалите наднатин с помощью пипетки.
Будьте осторожны, чтобы не потревожить дробину на дне. Лизис эритроцитов.
Теперь красные кровяные тельца в образце должны быть разрушены путем лизиса. Чтобы лизировать остаточные эритроциты, добавьте два миллилитра буфера для лизиса эритроцитов в пробирку для реанимации. Подвесьте гранулу вихревой во флаконе при установке трех-четырех.
Не увеличивайте настройку вихря выше четырех, так как это может привести к активации нейтрофилов. Может потребоваться сделать вихрь вихрем в течение нескольких секунд или импульсировать вихрь, чтобы растворить нёбо. Центрифугируйте раствор для лизиса при 250 RCF в течение пяти минут.
Используйте опцию плавного пуска, чтобы свести к минимуму повреждение образца. Удалите наднатин с помощью пипетки. Повторите процесс лизирования.
При необходимости выпустите суспензию нейтрофилов, добавьте в каждую трубку по 500 микролитров HBSS без кальция. Вихревую гранулу при настройке три-четыре, разбавить до 10 миллилитров с помощью HPSS без кальциевой центрифуги. Нейтрофилы при 250 RCF в течение пяти минут отсасывают снат и отбрасывают его.
Повторно суспендируйте гранулу в 250 микролитрах HBSS с раствором HSA, два раза по 10 на шесть. Обычно собираются нейтрофилы на миллилитр.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод изоляции нейтрофилов человека из цельной крови с использованием стандартной методики разделения по плотности градиента. Нейтрофилы играют важную роль в воспалительном иммунном ответе, и понимание их изоляции важно для дальнейших исследований.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Клеточная биология
- Нейробиология
Фон
- Нейтрофилы являются одними из первых ответов на воспалительные реакции.
- Их функции и механизмы были широко изучены in vitro.
- Методы изоляции важны для исследования поведения и функций нейтрофилов.
- Стандартизированные методы улучшают воспроизводимость исследований.
Цель исследования
- Продемонстрировать надежный метод изоляции нейтрофилов из человеческой крови.
- Способствовать дальнейшим исследованиям функций нейтрофилов при воспалении.
- Предоставить протокол, который может быть легко адаптирован в лабораториях.
Используемые методы
- Метод разделения по плотности градиента.
- Использование коммерчески доступных средств разделения.
- Оборудование включает центрифугу и пробирки.
- Приготовление растворов с использованием HBSS с хлоридом кальция и альбумином человеческой сыворотки.
Основные результаты
- Успешная изоляция нейтрофилов из образцов цельной крови.
- Демонстрация эффективности метода разделения.
- Предоставление четкого протокола для исследователей.
- Потенциальные применения в изучении поведения нейтрофилов в различных условиях.
Выводы
- Представленный метод эффективен для изоляции нейтрофилов.
- Этот протокол может улучшить исследования иммунных ответов.
- Дальнейшие исследования могут основываться на этой методике изоляции.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
