Окрашивание белков в гелях

В предыдущем видео под названием «Электрофоретическое разделение белков» мы продемонстрировали, как сложная смесь белков может быть разделена с помощью гель-электрофореза. В этом видео мы покажем вам четыре различных метода окрашивания гелем для визуализации расположения белков в геле. Здравствуйте, я Шон Галлахер из UVP, работаю с Центром протеомики здесь, в Институте аспирантуры KEG.

Сегодня я покажу вам несколько методов визуализации белков после разделения с помощью электрофореза. Это включает в себя серебристое окрашивание Kamasi, сиро-оранжевый и сиро-рубин. Итак, давайте начнем с Kamasi blue First.

Обнаружение белковых запретов в геле с помощью окрашивания синим Камаси зависит от неспецифического связывания красителя. В данном случае Камаси блестящий синий G два 50. При этом методе белки, отделенные в полиакриламидном геле, промываются водой высокой чистоты.

Затем местоположение белков определяется с помощью синего красителя камаси на водной основе. Предел обнаружения составляет от 0,3 до одного микрограмма на полосу белка. Для начала начните с полиакриламидного геля, в котором белки были разделены с помощью электрофореза.

Медленно перемешивая полиакриламидный гель, поместите его в пластиковую емкость, наполненную 300 миллилитрами воды высокой чистоты. Оставьте на пять минут. Выбросьте и повторите еще два раза после третьей стирки.

Слейте воду и покройте гель раствором для окрашивания Kamasi blue на один час, медленно перемешивая после одного часа окрашивания, вылейте раствор для окрашивания. Кратковременно смойте гель, поместив его примерно в 200 миллилитров воды на 30 минут. На этом этапе гель может храниться в воде для будущей визуализации.

Гель также может быть высушен на этом этапе для поддержания постоянной гелевой записи. Для этого поместите гель на два листа фильтровальной бумаги Watman толщиной три мм и накройте сверху полиэтиленовой пленкой. Затем высушите в обычной гелевой сушилке в течение одного-двух часов при температуре около 80 градусов по Цельсию.

Еще один метод окрашивания белками – окрашивание серебром, которое мы продемонстрируем далее. Несмотря на то, что метод окрашивания в синий цвет Камаси является более простым и быстрым, окрашивание серебром значительно более чувствительно с пределом обнаружения 0,3 нанограмма БСА. Обнаружение белковых полос в геле при окрашивании серебром зависит от связывания серебра с различными химическими группами в белке.

Следующий протокол основан на наборе для окрашивания серебра Silver Quest от in Vitrogen. Протокол основан на протоколе быстрого окрашивания, продолжительностью около 30 минут, и представляет собой одну из многих химических составов, используемых для окрашивания серебра, совместимых с масс-спектрометрией. В этом случае мы будем использовать предварительно изготовленный мини-гель in vitrogен перед началом окрашивания серебром.

Обязательно всегда надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения отпечатками пальцев. Поместите гель в лоток, пригодный для использования в микроволновой печи, со 100 миллилитровыми реагентами воды. Коротко промойте, а затем слейте воду.

Далее добавьте 100 миллилитров фиксатора, состоящего из 40% этанола, 10% уксусной кислоты в воду высокой чистоты и поставьте в микроволновую печь на 30 секунд. Микроволновый процесс сокращает необходимые этапы инкубации за счет ускорения связывания и окрашивания. На этом этапе поместите гель на шейкер и медленно покачивайте в течение пяти минут.

Через пять минут слейте фиксатор, добавьте 100 миллилитров, 30% этанола, чтобы промыть гель в микроволновой печи в течение 30 секунд, а затем поместите гель на шейкер на пять минут. Через пять минут слейте этанол. Теперь добавьте 100 миллилитров сенсибилизирующего реагента в микроволновую печь на 30 секунд, а затем поместите на шейкер на две минуты.

По прошествии двух минут слейте сенсибилизирующий реагент. Добавьте 100 миллилитров реагента в микроволновую печь на 30 секунд и поставьте на шейкер на две минуты. Слейте и повторите в общей сложности два цикла стирки.

Теперь добавьте 100 миллилитров раствора для окрашивания, поставьте в микроволновую печь на 30 секунд и медленно помешивайте в течение пяти минут. По прошествии пяти минут слейте раствор для окрашивания. Добавьте 100 миллилитров реагентной воды, пропустите микроволновую печь, ступеньку и поставьте прямо на шейкер на 20-60 секунд.

Слейте воду и сразу же добавьте 100 миллилитров проявляющего раствора и развивайте до тех пор, пока не станут видны белковые полосы. Если фон остается чистым, это займет примерно от пяти до 10 минут. На этом этапе добавьте 10 миллилитров раствора пробки в проявитель, чтобы остановить разработку для достижения наилучших результатов.

Фотографируйте гель как можно скорее, так как могут наблюдаться незначительные изменения интенсивности цвета и увеличение неспецифических фоновых элементов. Со временем гель, который вы видите, содержит остаточные белки После электроблоттинга высушите гель, чтобы сохранить постоянную запись, или храните в герметичном пластиковом пакете. Далее мы продемонстрируем метод флуоресцентного окрашивания гелей.

Флуоресцентные красители имеют ряд преимуществ перед традиционными белковыми красителями. Сипро оранжевые протеиновые гелевые красители, которые мы опишем здесь, могут обнаруживать от одного до двух нанограммов белка на полосу. Это более чувствительно, чем окрашивание бриллиантовым синим цветом камаси, и так же чувствительно, как многие техники окрашивания серебром.

Флуоресцентное окрашивание является простым и требует меньше времени, чем обычные протоколы окрашивания серебром, и выполняется менее чем за один час. Окрашенные белки можно визуализировать с помощью стандартного 300-нанометрового ультрафиолетового транслюминатора или лазерного сканера. В этом случае мы снова будем использовать предварительно изготовленный мини-гель in vitrogen для начала приготовления и разделения белков с помощью страницы SDS.

Но используйте 0,05% SDS в рабочем буфере вместо обычных 0,1% SDS, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию. Чтобы начать процедуру окрашивания, налейте в небольшую пластиковую посуду раствор для флуоресцентного окрашивания ципрооранжевого цвета для одного или двух мини-гелей стандартного размера. Используйте около 50 миллилитров раствора для окрашивания.

Важно отметить, что посуду с пятнами следует очистить и хорошо промыть перед использованием, так как любые моющие средства будут мешать появлению пятен. Теперь поместите гель в раствор для окрашивания. Накройте емкость алюминиевой фольгой, чтобы защитить краситель от яркого света.

Аккуратно взбалтывайте гель при комнатной температуре в течение 40-60 минут. Слейте раствор для окрашивания, а затем смойте гель менее чем на одну минуту с 7,5% уксусной кислотой, около 100 миллилитров, чтобы удалить излишки пятна с поверхности геля, задержите гель путем инкубации в течение ночи при температуре 0,1% 20 для визуализации и фотографирования белковых полос. Поместите гель с флуоресцентной меткой непосредственно на стандартный 300-нанометровый транслюминатор или синий световой транслюминатор.

Далее мы продемонстрируем альтернативный метод флуоресцентного окрашивания, в котором используется флуоресцентный краситель Cipro рубин. Метод окрашивания рубином Cipro был разработан специально для использования на двухмерных страницах, но оказался наиболее чувствительным белковым гелевым окрашиванием для стандартной одномерной страницы SDS. Для начала переложите гель в чистую полипропиленовую или ПВХ посуду соответствующего размера.

Инкубируйте гель в соответствующем количестве неразбавленного гелевого красителя с рубиновым протеином с непрерывным легким перемешиванием на орбитальном шейкере со скоростью 50 об/мин. Накройте гель и инкубируйте не менее трех часов. Переложите гель в чистую посуду для окрашивания и промойте ее один раз в растворе 10% метанола, 7% уксусной кислоты, восстановите и поместите гель обратно на коромысло на 30 минут.

Чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию и повысить чувствительность, гель теперь готов к просмотру и фотографированию. Хочу поблагодарить вас за то, что вы сегодня посмотрели сегодняшние протоколы. Мы показали вам ряд различных процедур визуализации белков после электрофореза.

Некоторые из них очень чувствительны, такие как флуоресцентное окрашивание и серебряное окрашивание, а некоторые являются рутинными, такие как окрашивание в синий цвет камаси. Важно помнить, что чистота реагентов имеет решающее значение. Использование ультрачистой воды также очень важно, как и время на каждом из этапов.

На это нужно обратить пристальное внимание, чтобы получить воспроизводимые результаты. Вот и все, и удачи в следующих экспериментах.