Флуоресцентное окрашивание серебром: методика визуализации общего белка в полиакриламидных гелях

Флуоресцентное окрашивание серебра белков в полиакриламидных гелях использует флуорогенные зонды для обнаружения и количественного определения белков.

Начните с полиакриламидного геля с белками, разделенными на полосы с помощью электрофореза. Замочите в фиксирующей смеси этанола и уксусной кислоты, которая предотвращает диффузию полос за счет денатурации белков.

Смойте гель, чтобы удалить остатки уксусной кислоты и этанола. Погрузите гель в пятно серебристой селитры. Ионы серебра прочно связываются с отрицательно заряженными группами белков.

Инкубируйте в темноте. Промойте гель в ультрачистой воде, чтобы удалить несвязанные комплексы ионов серебра.

Погрузите гель в проявочный раствор, содержащий многокомпонентный флуорогенный зонд - TPE-4TA. Этот анионный зонд нацелен на ионы серебра, связанные с белком, образуя нерастворимые агрегаты, которые активируют флуорогенные свойства зонда, тем самым придавая флуоресценцию.

Поскольку флуоресцентная активация зависит от агрегации, несвязанные зонды не излучают никакого сигнала, что позволяет проводить полное окрашивание белков с уменьшенным фоновым излучением.

Инкубируйте гель в темноте при легком перемешивании, обеспечивая полное развитие флурогенных тканей. Перенесите гель в буфер для удаления пятен, чтобы удалить несвязанные зонды. Наконец, визуализируйте гель, чтобы получить интенсивность сигнала полосы. Постройте график интенсивности сигнала флуоресценции относительно стандартной белковой кривой, чтобы рассчитать общее количество белков в образце.

После электрофореза погрузите гель в 100-миллилитровый раствор, содержащий этанол и уксусную кислоту, в орбитальный шейкер и дважды инкубируйте в течение 30 минут каждый, при комнатной температуре, встряхивая при 50 об/мин. Далее трижды смойте гель сверхчистой водой в чистой емкости, при этом каждое умывание длится 10 минут.

Сначала растворите 0,01 грамма нитрата серебра в 10 миллилитрах сверхчистой воды, чтобы приготовить стоковый раствор с концентрацией 0,1%. Добавьте 100 микролитров этого исходного раствора в 100 миллилитров сверхчистой воды, чтобы получился рабочий раствор нитрата серебра. В вытяжной шкаф погрузите гель в 100 миллилитров рабочего раствора нитрата серебра в герметичную стеклянную камеру.

Используйте алюминиевую фольгу для защиты геля от света во время пропитки и инкубируйте в течение 1 часа, встряхивая со скоростью 50 об/мин на орбитальном шейкере. После этого дважды смойте гель сверхчистой водой в чистой емкости, при этом при каждом смывании используется примерно 100 миллилитров воды и длится 60 секунд.

Важно использовать сверхчистую воду для очистки геля после этапа пропитки серебром, чтобы свести к минимуму фоновое окрашивание.

Сначала добавьте 50 миллилитров сверхчистой воды к 3 миллиграм красителя TPE-4TA. Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение 3 минут и добавляйте 5 микролитров 1 молярного раствора гидроксида натрия между каждым сеансом ультразвуковой обработки, чтобы помочь растворить краситель, обычно до трех раз. Затем проверьте флуоресценцию раствора под 365-нанометровой ультрафиолетовой лампой, чтобы убедиться, что краситель полностью растворился. Только слабые или неэмиссионные растворы указывают на полное растворение.

Для приготовления флуорогенного проявочного раствора добавьте 10 миллилитров стокового раствора ТПЭ-4ТА в 90 миллилитров сверхчистой воды. Используйте рН-метр для проверки рН раствора. Настройте раствор на pH от 7 до 9, используя разбавленный раствор гидроксида натрия или уксусную кислоту, если pH выходит за пределы допустимого диапазона.

Затем переложите гель в чистую и герметичную емкость со 100 миллилитрами раствора флуорогенного проявлятеля и убедитесь, что гель полностью погружен. Закройте контейнер и накройте его крышкой, чтобы защитить от света. Встряхните контейнер на ночь на орбитальном шейкере при 50 об/мин и комнатной температуре.

Переложите гель в чистую емкость, и удалите из него 100 миллилитров 10% этанола в течение 30 минут. Затем смойте гель в ультрачистой воде в течение 5 минут. Гель может быть визуализирован с помощью настольного трансиллюминатора или отображен на машине для документирования геля в 365-нанометровом или 302-нанометровом канале.