Back to chapter

4.4:

Равновесная константа связывания и сила связывания

JoVE Core
Molecular Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.  Sign in or start your free trial.
JoVE Core Molecular Biology
The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

Languages

Share

В клетке, белки беспорядочно сталкиваются с другими молекулами, такими, как другие белки, нуклеиновые кислоты, и небольшие молекулы лиганды. Если связывание неспецифично, малое число нековалентных взаимодействий между молекулами приводит в краткой ассоциации. Если определенный лиганд связывается с белком, он образует обширные нековалентные взаимодействия вдоль дополняющих поверхностей.Такие комплексы стабильны, и долго сохраняются прежде чем отсоединиться. Сила связывающих взаимодействий сообщается в терминах константы равновесия, Кб, также называемой константа связи или ассоциации. KB можно рассчитать исходя из отношения концентрации белково-лигандового комплекса к концентрациям несвязанных белков и лиганд, найденым в состоянии равновесия.Учитывая ее связь с изменением свободной энергии из-за связывания, Высокое значение Kb означает существенное уменьшение дельта G, указывающее на сильное сродство между белком и лигандом. Два конкурирующих процесса важны для связывания типа белок-лиганд. Ассоциация белка и лиганда для сформировния комплекса и диссоциации комплекса в реактанты.Константа связи K_on это мера числа связываний в секунду между белком и его лигандом. Её можно использовать для расчета скорости связывания лиганда с белком при данной концентрации. И наоборот, K_off это мера числа диссоциаций.Его можно использовать для расчета, как быстро комплекс развалится, когда скорость ассоциации равна скорости диссоциации и достигнуто равновесие, при чём концентрации продуктов и реактантов остаются постоянными. Таким образом, в равновесии, K_on умножить на продукт при равновесных концентрациях белка и лиганда, равен K_off умножиьт на равновесную концентрацию белково-лигандового комплекса. Переупорядочивание этого выражения также показывает, что отношение K_ON к K_OFF равно Kb в равновесии.

4.4:

Равновесная константа связывания и сила связывания

Константа равновесного связывания (Kb) количественно определяет силу взаимодействия белок-лиганд. Kbможно рассчитать следующим образом, когда реакция находится в равновесии:

где  P и L представляют собой несвязанный белок и лиганд соответственно, а PL представляет собой комплекс белок-лиганд. 

Поскольку количество связанного лиганда также связано со скоростью связывания лиганда, эксперименты также могут определятьKb путем изучения скоростей связывания белка и лиганда (kon) и их диссоциации (koff) с использованием следующего соотношения:

Таким образом, две категории  методов анализа связывания используются для определения константы равновесного связывания – те, которые измеряют равновесные концентрации, и те, которые измеряют кинетику реакции. В данном случае, реакция должна быть в равновесии во время измерения.

Метод определения равновесных концентраций зависит от желаемой чувствительности и простоты обнаружения сигнала. По этим причинам наиболее широко используются спектроскопические методы. В этих экспериментах реакция вызывает изменение оптической плотности реагента или продукта при заданной длине волны, обнаруживаемое оптическим спектрофотометром. В качестве альтернативы реагент или продукт могут быть помечены флуоресцентной меткой или содержать собственный флюорофор. Затем ход реакции можно измерить по изменению флуоресценции. Эти анализы проводятся путем изменения концентрации одного реагента, в то время как остальная часть эксперимента остается постоянной. Затем результаты могут быть нанесены на график и проанализированы с помощью различных методов построения кривой.

Взаимодействие между белками и лигандами также изучается с использованием различных биохимических и спектроскопических методов. Структурный анализ с использованием рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии посредством молекулярного моделирования помогает прогнозировать взаимодействия белок-лиганд. Теоретические и вычислительные подходы, такие как исследования стыковки белков с лигандами, широко используются для определения положения и взаимодействия низкомолекулярных лигандов, в том числе кандидатов в лекарственные препараты. Компьютерный дизайн лекарств – это быстрая и недорогая альтернатива, ускоряющая темпы традиционного тестирования лекарств методом проб и ошибок.

Suggested Reading

  1. Pollard, Thomas D. "A guide to simple and informative binding assays." Molecular biology of the cell 21, no. 23 (2010): 4061-4067.
  2. Hulme, Edward C., and Mike A. Trevethick. "Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation." British journal of pharmacology 161, no. 6 (2010): 1219-1237.
  3. Medina-Franco, José L., Oscar Méndez-Lucio, and Karina Martinez-Mayorga. "The interplay between molecular modeling and chemoinformatics to characterize protein–ligand and protein–protein interactions landscapes for drug discovery." In Advances in protein chemistry and structural biology, vol. 96, pp. 1-37. Academic Press, 2014.