4.4:
Равновесная константа связывания и сила связывания
4.4:
Равновесная константа связывания и сила связывания
Константа равновесного связывания (Kb) количественно определяет силу взаимодействия белок-лиганд. Kbможно рассчитать следующим образом, когда реакция находится в равновесии:
где P и L представляют собой несвязанный белок и лиганд соответственно, а PL представляет собой комплекс белок-лиганд.
Поскольку количество связанного лиганда также связано со скоростью связывания лиганда, эксперименты также могут определятьKb путем изучения скоростей связывания белка и лиганда (kon) и их диссоциации (koff) с использованием следующего соотношения:
Таким образом, две категории методов анализа связывания используются для определения константы равновесного связывания – те, которые измеряют равновесные концентрации, и те, которые измеряют кинетику реакции. В данном случае, реакция должна быть в равновесии во время измерения.
Метод определения равновесных концентраций зависит от желаемой чувствительности и простоты обнаружения сигнала. По этим причинам наиболее широко используются спектроскопические методы. В этих экспериментах реакция вызывает изменение оптической плотности реагента или продукта при заданной длине волны, обнаруживаемое оптическим спектрофотометром. В качестве альтернативы реагент или продукт могут быть помечены флуоресцентной меткой или содержать собственный флюорофор. Затем ход реакции можно измерить по изменению флуоресценции. Эти анализы проводятся путем изменения концентрации одного реагента, в то время как остальная часть эксперимента остается постоянной. Затем результаты могут быть нанесены на график и проанализированы с помощью различных методов построения кривой.
Взаимодействие между белками и лигандами также изучается с использованием различных биохимических и спектроскопических методов. Структурный анализ с использованием рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии посредством молекулярного моделирования помогает прогнозировать взаимодействия белок-лиганд. Теоретические и вычислительные подходы, такие как исследования стыковки белков с лигандами, широко используются для определения положения и взаимодействия низкомолекулярных лигандов, в том числе кандидатов в лекарственные препараты. Компьютерный дизайн лекарств – это быстрая и недорогая альтернатива, ускоряющая темпы традиционного тестирования лекарств методом проб и ошибок.
Suggested Reading
- Pollard, Thomas D. "A guide to simple and informative binding assays." Molecular biology of the cell 21, no. 23 (2010): 4061-4067.
- Hulme, Edward C., and Mike A. Trevethick. "Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation." British journal of pharmacology 161, no. 6 (2010): 1219-1237.
- Medina-Franco, José L., Oscar Méndez-Lucio, and Karina Martinez-Mayorga. "The interplay between molecular modeling and chemoinformatics to characterize protein–ligand and protein–protein interactions landscapes for drug discovery." In Advances in protein chemistry and structural biology, vol. 96, pp. 1-37. Academic Press, 2014.