Chapter 4: Protein Function

Back to chapter

4.4:

Denge Bağlanma Sabiti ve Bağlanma Kuvveti

JoVE Core
Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Core Molecular Biology

The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

Previous Video
4.3: Conserved Binding Sites

Next Video
4.5: Cofactors and Coenzymes

Languages

Share

English العربية 中文 Nederlands français Deutsch עברית italiano 日本語 한국어 português русский español Türkçe

Hücrede proteinler;diğer proteinler, nükleik asitler gibi diğer moleküllerle ve küçük molekül ligandları ile rastgele çarpışır. Bağlanma spesifik değilse, moleküller arasında az sayıda, kovalent olmayan etkileşim, kısa süreli bir birleşme ile sonuçlanır. Proteine, spesifik bir ligand bağlanırsa, tamamlayıcı yüzeyler boyunca geniş çaplı, kovalent olmayan etkileşimler oluşturur.Bu tip kompleksler kararlıdır ve ayrılmadan önce uzun süre bağlı kalırlar. Bir bağlanma etkileşiminin gücü, bağlanma veya birleşme sabiti olarak da adlandırılan, denge sabiti Kb cinsinden ifade edilir. Kb, denge halinde, protein-ligand kompleksi konsantrasyonunun bağlanmamış protein ve ligand konsantrasyonuna oranından hesaplanabilir.Serbest enerjide bağlanmadan kaynaklanan değişim ile ilişkisi göz önüne alındığında, daha büyük Kb, delta G’de büyük bir azalma anlamına gelir;bu da protein ve ligand arasında güçlü bir afinite olduğunu gösterir. Protein-ligand bağlanması için iki rakip süreç önemlidir:Bir kompleks oluşturmak için bir protein ve bir ligandın birleşmesi ve kompleksin reaktanlara ayrılması. Birleşme sabiti K_on, bir protein ve onun ligandı arasındaki saniye başına gerçekleşen bağlanma olayı sayısının bir ölçüsüdür.Belirli bir konsantrasyonda proteine ligand bağlanma hızını hesaplamak için kullanılabilir. Tersine, K_off, ayrılma olayı sayısının bir ölçüsüdür. Birleşme hızı ayrılma hızına eşit olduğunda ve ürünlerin ve reaktanların konsantrasyonlarının sabit kaldığı denge haline ulaşıldığında, kompleksin ne kadar hızlı parçalandığını hesaplamak için bu değer kullanılabilir.Bu nedenle, denge halinde, K_on çarpı protein ve ligand denge konsantrasyonlarının çarpımı, K_off çarpı protein-ligand kompleksinin denge konsantrasyonuna eşittir. Bu ifade yeniden düzenlendiğinde, denge halinde K_on’un K_off’a oranının Kb’ye eşit olduğunu görürüz.

4.4:

Denge Bağlanma Sabiti ve Bağlanma Kuvveti

Denge bağlanma sabiti (K_b), bir protein-ligand etkileşiminin gücünü ölçer. Reaksiyon dengede olduğunda K_b aşağıdaki gibi hesaplanabilir:

burada P ve L sırası ile bağlanmamış protein ve ligand, PL ise protein-ligand komleksidir.

As the amount of bound ligand is also related to the rate of ligand binding, experiments can also determine K_b by examining the rates of protein-ligand association (k_on) and dissociation (k_off) using the following ratio:

Bağlı ligand miktarı da ligand bağlanma oranı ile ilişkili olduğundan, deneylerde ayrıca protein-ligand ilişki oranları (k_on) ve ayrışma oranları (k_off) incelenerek K_b aşağıdaki formül ile hesaplanabilir:

style=””text-align: center””>

Bu nedenle, denge bağlanma sabitini belirlemek için iki bağlanma testi kategorisi kullanılır-denge konsantrasyonlarını ölçenler ve bir reaksiyonun kinetiğini ölçenler. Bu durumda, reaksiyon ölçüm sırasında dengede olmalıdır.

Denge konsantrasyonlarını belirleme yöntemi, istenen hassasiyete ve sinyal algılama kolaylığına bağlıdır. Bu nedenlerden dolayı en yaygın olarak spektroskopik analizler kullanılmaktadır. Bu deneylerde, reaksiyon, bir UV-Vis spektrofotometresi tarafından tespit edilebilen belirli bir dalga boyunda bir reaktan veya bir ürünün absorbans değişikliği ölçülür. Alternatif olarak, reaktif veya ürün bir floresan prob ile etiketlenebilir veya içsel bir florofor kullanılabilir. Daha sonra, reaksiyon ilerlemesi floresans miktarındaki değişiklikten ölçülebilir. Bu analizler, bir reaktan konsantrasyonunun değiştirilmesiyle gerçekleştirilirken, deneyin geri kalanı sabit tutulur. Sonuçlar daha sonra çeşitli eğri uydurma yöntemleri ile grafiklenebilir ve analiz edilebilir.

Proteinler ve ligandlar arasındaki etkileşimler ayrıca çeşitli biyokimyasal ve spektroskopik teknikler kullanılarak incelenir. Yapısal analiz, X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi kullanarak, moleküler simülasyonlar yoluyla protein-ligand etkileşimleri tahmin edilebilir. Protein-ligand yerleştirme çalışmaları gibi teorik ve hesaplamalı yaklaşımlar, ilaç adayları da dahil olmak üzere küçük molekül ligandlarının konumunu ve etkileşimlerini karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bilgisayar destekli ilaç tasarımı, geleneksel deneme yanılma ilaç test süreçlerini hızlandırmak için hızlı ve düşük maliyetli bir alternatiftir.

Suggested Reading

Pollard, Thomas D. "A guide to simple and informative binding assays." Molecular biology of the cell 21, no. 23 (2010): 4061-4067.
Hulme, Edward C., and Mike A. Trevethick. "Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation." British journal of pharmacology 161, no. 6 (2010): 1219-1237.
Medina-Franco, José L., Oscar Méndez-Lucio, and Karina Martinez-Mayorga. "The interplay between molecular modeling and chemoinformatics to characterize protein–ligand and protein–protein interactions landscapes for drug discovery." In Advances in protein chemistry and structural biology, vol. 96, pp. 1-37. Academic Press, 2014.

Tags

Equilibrium Binding Constant Binding Strength Non-specific Binding Specific Ligand Binding Non-covalent Interactions Stable Complexes Dissociation Concentration Ratio Affinity Association Constant Kon Ligand Binding Rate Dissociation Constant Koff