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4.4:

La constante d'association à l'équilibre et la force des liaisons

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Molecular Biology
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The Equilibrium Binding Constant and Binding Strength

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Dans la cellule, les protéines entrent en collision aléatoire avec d’autres molécules, comme d’autres protéines, des acides nucléiques et des petites molécules ligands. Si la liaison est non-spécifique, peu d’interactions non-covalentes entre les molécules entraînent une brève association. Si un ligand spécifique se lie à la protéine, il forme de vastes interactions non-covalentes le long des surfaces complémentaires.Ces complexes sont stables, restant longtemps liés avant de se dissocier. La force d’une interaction de liaison est rapportée en termes de sa constante d’équilibre, Kb, également appelée liaison ou constante d’association. Le Kb peut être calculé à partir du rapport de la concentration du complexe protéine-ligand sur les concentrations de protéines non-liées et de ligands trouvés à l’équilibre.Étant donné sa relation avec le changement d’énergie libre dû à la liaison, une valeur impotante de Kb signifie une forte diminution du delta G indiquant une forte affinité entre la protéine et le ligand. Deux processus concurrents sont importants pour la liaison protéine-ligand. L’association d’une protéine et d’un ligand pour former un complexe et la dissociation du complexe en réactifs.La constante d’association K on est une mesure du nombre d’événements de liaison par seconde entre une protéine et son ligand. Il peut être utilisé pour calculer le taux de liaison du ligand à la protéine à une concentration donnée. Inversement, K off est une mesure du nombre d’événements de dissociation.Il peut être utilisé pour calculer la vitesse à laquel un complexe se défait lorsque le taux d’association est égal au taux de dissociation et que l’équilibre est atteint, où les concentrations de produits et de réactifs restent constantes. Ainsi, à l’équilibre, le K on multiplié par le produit des concentrations d’équilibre de la protéine et du ligand, est égal au K off multiplié par la concentration d’équilibre du complexe protéine-ligand. La réorganisation de cette expression montre également que le rapport de K on sur K off est égal au Kb à l’équilibre.

4.4:

La constante d'association à l'équilibre et la force des liaisons

La constante de liaison à l’équilibre (Kb) quantifie la force d’une interaction protéine-ligand. Kb peut être calculé comme suit lorsque la réaction est à l’équilibre :

où  P et L sont respectivement la protéine et le ligand non liés, et PL est le complexe protéine-ligand. 

Comme la quantité de ligand lié est également liée au taux de liaison du ligand, les expériences peuvent également déterminer Kb en examinant les taux d’association protéine-ligand (kon) et la dissociation (koff) en utilisant le ratio suivant :

Ainsi, deux catégories de  tests de liaison sont utilisés pour déterminer la constante de liaison à l’équilibre – ceux qui mesurent les concentrations d’équilibre et ceux qui mesurent la cinétique d’une réaction. Dans ce cas, la réaction doit être à l’équilibre au moment de la mesure.

La méthode de détermination des concentrations d’équilibre dépend de la sensibilité souhaitée et de la facilité de détection du signal. Pour ces raisons, les dosages spectroscopiques sont les plus largement utilisés. Dans ces expériences, la réaction produit un changement d’absorbance d’un réactif ou d’un produit à une longueur d’onde donnée, détectable par un spectrophotomètre UV-Vis. En variante, le réactif ou le produit peut être marqué avec une sonde fluorescente ou peut contenir un fluorophore intrinsèque. Ensuite, la progression de la réaction peut être mesurée à partir du changement de fluorescence. Ces tests sont effectués en faisant varier les concentrations d’un réactif tandis que le reste de l’expérience est maintenu constant. Les résultats peuvent ensuite être représentés graphiquement et analysés avec diverses méthodes d’ajustement de courbe.

Les interactions entre protéines et ligands sont également étudiées à l’aide de diverses techniques biochimiques et spectroscopiques. L’analyse structurelle, utilisant la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN, aide à prédire les interactions protéine-ligand grâce à des simulations moléculaires. Les approches théoriques et informatiques, telles que les études d’amarrage protéine-ligand, sont largement utilisées pour caractériser la position et les interactions des ligands de petites molécules, y compris les candidats médicaments. La conception de médicaments assistée par ordinateur est une alternative rapide et peu coûteuse pour accélérer le rythme des essais et erreurs conventionnels de dépistage des médicaments.

Suggested Reading

  1. Pollard, Thomas D. "A guide to simple and informative binding assays." Molecular biology of the cell 21, no. 23 (2010): 4061-4067.
  2. Hulme, Edward C., and Mike A. Trevethick. "Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation." British journal of pharmacology 161, no. 6 (2010): 1219-1237.
  3. Medina-Franco, José L., Oscar Méndez-Lucio, and Karina Martinez-Mayorga. "The interplay between molecular modeling and chemoinformatics to characterize protein–ligand and protein–protein interactions landscapes for drug discovery." In Advances in protein chemistry and structural biology, vol. 96, pp. 1-37. Academic Press, 2014.