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7.16:

Recombinaison site-spécifique et variation de phase

JoVE Core
Molecular Biology
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JoVE Core Molecular Biology
Conservative Site-specific Recombination and Phase Variation

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La recombination site-spécifique est un type d’échange génétique où des enzymes spécialisées, appelées recombinases spécifiques de site, catalysent le mouvement des sections d’ADN entre des sites définis qui partagent une certaine homologie de séquence. Lorsque de tels mouvements se produisent, les régions à échanger sont généralement flanquées d’une paire de séquences symétriques composées d’ADN double brin d’environ 20 à 30 paires de base de long. Les enzymes spécialisées, appelées recombinases, qui se lient à ces séquences peuvent appartenir à des familles sérine ou tyrosine recombinase.Les familles ont un résidu de sérine ou de tyrosine au niveau du site actif de l’enzyme et utilisent des mécanismes distincts. Dans le cas de la sérine recombinase, les sous-unités se lient d’abord spécifiquement à leurs nouvelles séquences de reconnaissance formant un complexe synaptique. Ensuite, la sérine du site actif attaque le phosphodiester de l’ADN au centre de ces séquences, créant ainsi des points d’arrêt connus sous le nom de sites crossover.Ensuite, les sérine recombinases coupent toutes les hélices d’ADN impliquées avant que l’échange de brin ne se déroule. En revanche, les tyrosine recombinases se lient de la même manière, mais coupent et rejoignent un brin de l’ADN duplex à la fois. Le résidu de tyrosine se lie alors de façon covalente à l’extrémité trois prime du brin clivé, tandis que les groupes hydroxyles libres en cinq prime attaquent la protéine de liaison à l’ADN formant une jonction de Holliday.Ce modèle complexe est le premier événement d’enjambement. Ensuite, lorsque les brins d’ADN restants sont clivés et échangés par les sous-unités de recombinase dans le second cas, la jonction de Holliday est réparée en produits recombinants. Il existe trois conséquences potentielles de tels événements de recombinaison.Le premier, est l’intégration dans laquelle une molécule d’ADN circulaire est insérée dans un second ADN linéaire. Lorsque les deux sites sont sur la même molécule d’ADN, le deuxième résultat peut être l’excision, où la partie de l’ADN découpé est simplement retirée, libre de s’intégrer ailleurs dans le génome. Dans le troisième scénario, si les sites d’incision sont dans des orientations opposées, l’inversion peut se produire là où la section d’ADN est retirée, puis réintégrée dans l’orientation opposée.Un exemple bien étudié de ce phénomène est l’inversion spécifique du site d’un segment chromosomique de la bactérie salmonelle, qui lui permet de produire deux types différents de flageline selon l’environnement. Et ce processus est appelé variation de phase.

7.16:

Recombinaison site-spécifique et variation de phase

Du fait que les segments d’ADN soient coupés et réorganisés d’une manière spécifique à la direction, la recombinaison site-spécifique est apparue comme une technique de génie génétique efficace. Les recombinases Flippase (FLp) et Cre, sont deux membres de la famille des tyrosine recombinases dérivée de bactériophages, qui sont utilisées pour médier les insertions d’ADN spécifiques à un site, les suppressions et l’expression ciblée de protéines dans les lignées cellulaires de mammifères.

Les sites de reconnaissance de la recombinase Cre appelés sites LoxP ont une longueur d’environ 34 paires de bases. Les sites LoxP contiennent des séquences palindromiques de 13 pb, ce qui signifie que la séquence nucléotidique est la même dans les deux directions à savoir 5’ à 3’ et 3’ à 5’. La recombinaison site-spécifique médiée par les recombinases Cre est l’une des méthodes les plus populaires utilisées dans la création de souris transgéniques avec des mutations acquises. L’utilisation de variantes thermostables de la recombinase Cre avec des promoteurs spécifiques aux tissus permet un contrôle spatial sur l’expression et l’action de la recombinase Cre. Par exemple, le fait de placer un promoteur Cadherin spécifique au rein en amont du gène Cre permet à l’enzyme d’être exprimée uniquement dans les tissus rénaux. Pour le contrôle temporel de l’activité de Cre, le gène de l’enzyme est fusionné avec un domaine de liaison au ligand de sorte que l’enzyme ne s’exprime qu’en présence du ligand spécifique.

Une limitation majeure de l’utilisation de la recombinaison spécifique au site comme outil d’édition du génome est que le ou les sites de recombinaison cibles doivent être insérés en premier ou doivent être présents par hasard. Si un site génomique congruent avec le site de reconnaissance enzymatique peut être présélectionné, les recombinases peuvent être utilisées avec une cible spécifique “ faite sur mesure”. Des études récentes ont utilisé la mutagenèse et le brassage de gènes pour concevoir des variantes Flp qui peuvent reconnaître fonctionnellement des sites avec des mutations combinatoires. Les résultats sont prometteurs pour les futures itérations du brassage de gènes qui peuvent produire des variantes Flp plus spécifiques et peuvent être utilisés commercialement comme outil moléculaire pour la conception de grands génomes.

Suggested Reading

  1. Yang, Wei. "Topoisomerases and site-specific recombinases: similarities in structure and mechanism." Critical reviews in biochemistry and molecular biology 45, no. 6 (2010): 520-534.
  2. Xiong, Ling, Xiaole L. Chen, Hannah R. Silver, Noreen T. Ahmed, and Erica S. Johnson. "Deficient SUMO attachment to Flp recombinase leads to homologous recombination-dependent hyperamplification of the yeast 2 μm circle plasmid." Molecular biology of the cell 20, no. 4 (2009): 1241-1251.