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7.16:

Recombinação Específica de Sítios Conservados e Variação de Fase

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Molecular Biology
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JoVE Core Molecular Biology
Conservative Site-specific Recombination and Phase Variation

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Recombinação sítio específica é um tipo de troca genética Onde enzimas especializadas, chamadas As recombinasses sítio especificas, catalisam o movimento de seções de DNA entre locais definidos que compartilham alguma homologia de sequência. Quando movimentos como estes ocorrem, as regiões a serem trocadas são tipicamente ladeado por um par de sequências simétricas compostas de DNA bicatenário com de cerca de 20 a 30 pares base de comprimento. As enzimas especializadas, chamadas recombinasses, que ligam a estas sequências podem pertencer as famílias de recombinasse da serina ou tirosina.As famílias têm uma serina ou um resíduo de tirosina no local ativo da enzima, e empregam mecanismos distintos. No caso da recombinasse serina, as subunidades ligam-se especificamente às suas novas sequências de reconhecimento formando um complexo sináptico. Então, a serina do local ativo ataca a cadeia do DNA do fosfodiéster no centro dessas sequências criando pontos de interrupção conhecidos como locais de cruzamento.Em seguida, as recombinasses de serinas cortarão todos os hélices envolvidos do DNA antes que a troca da fita prossiga. Em contraste, as recombinasses de tirosinas ligam da mesma maneira, mas cortam e juntam uma vertente do duplex do DNA de cada vez. O resíduo de tirosina então se une covalentemente com a extremidade três prime da fita clivada, quando os cinco primes livres de grupos hidroxila atacam o DNA da proteína que forma uma junção intermediária.Este padrão complexo é o primeiro evento de cruzamento. Então, quando as outras vertentes do DNA são clivadas e trocadas pelas subunidades de recombinasse, no segundo evento, a junção Holliday é resolvida aos produtos recombinantes. Há três resultados potenciais de eventos de recombinação como estes.O primeiro, é a integração em que uma molécula de DNA circular é inserida em um segundo DNA linear. Quando ambos os locais estão na mesma molécula do DNA, o segundo resultado pode ser a excisão, onde a parte do DNA cortada é simplesmente removida, livre para integrar em outra parte do genoma. No terceiro cenário, se os locais da incisão estão em orientações opostas, inversões podem ocorrer onde a seção do DNA é removida e então reintegrada na orientação oposta.Um exemplo bem estudado deste fenômeno é a inversão específica do local de um segmento cromossômico da bactéria Salmonela, que permite que ela produza dois tipos diferentes da proteína 00:02 44.720 00:02:47.700 flagelino dependendo do ambiente. E este processo é chamado de variação de fase.

7.16:

Recombinação Específica de Sítios Conservados e Variação de Fase

Como os segmentos de DNA são cortados e reorganizados em uma direção específica, a recombinação específica do local surgiu como uma técnica de engenharia genética eficiente. As recombinases Flipase e de Ciclidização ou Flp e Cre, respectivamente, são dois membros da família da tirosina recombinase derivadas de bacteriófagos, que são usadas para mediar inserções de DNA específicas do local, deleções, e expressão direcionada de proteínas em linhas celulares de mamíferos.

Os locais de reconhecimento para a Cre recombinase chamados locais LoxP têm cerca de 34 pares de bases de comprimento. Os locais LoxP contêm sequências palindrómicas de 13 pb, o que significa que a sequência de nucleótidos é lida da mesma forma nas direções de 5’ a 3’ e de 3’ a 5’. A recombinação específica do local mediada por Cre recombinases é um dos métodos mais utilizados na criação de murganhos transgénicos com mutações adquiridas. A utilização de variantes termoestáveis de Cre recombinase com promotores específicos de tecidos permite o controlo espacial da expressão e ação da Cre recombinase. Por exemplo, a colocação de um promotor de Caderina específico para o rim a montante do gene Cre permite que a enzima seja expressa apenas em tecidos renais. Para o controlo temporal da atividade da Cre recombinase, o gene da enzima é fundido com um domínio de ligação a ligandos, de forma a que a enzima seja expressa apenas na presença específica do ligando.

Uma grande limitação ao usar a recombinação específica do local como uma ferramenta de edição do genoma é que o local ou locais de destino de recombinação devem ser inseridos primeiro ou devem estar presentes por acaso. Se um local genómico congruente com o local de reconhecimento da enzima puder ser pré-selecionado, as recombinases podem ser usadas com especificidade alvo “feita por encomenda”. Estudos recentes têm utilizado mutagénese e mistura de genes para desenvolver variantes de Flp que possam reconhecer funcionalmente locais com mutações combinatoriais. Os resultados são promissores para iterações futuras de misturas de genes que podem produzir variantes mais específicas de Flp e podem ser usadas comercialmente como uma ferramenta molecular para a engenharia genética de grandes genomas.

Suggested Reading

  1. Yang, Wei. "Topoisomerases and site-specific recombinases: similarities in structure and mechanism." Critical reviews in biochemistry and molecular biology 45, no. 6 (2010): 520-534.
  2. Xiong, Ling, Xiaole L. Chen, Hannah R. Silver, Noreen T. Ahmed, and Erica S. Johnson. "Deficient SUMO attachment to Flp recombinase leads to homologous recombination-dependent hyperamplification of the yeast 2 μm circle plasmid." Molecular biology of the cell 20, no. 4 (2009): 1241-1251.