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7.16:

Ricombinazione conservativa sito-specifica e variazione di fase

JoVE Core
Molecular Biology
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JoVE Core Molecular Biology
Conservative Site-specific Recombination and Phase Variation

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La ricombinazione specifica del sito è un tipo di scambio genetico dove enzimi specializzati, chiamati ricombinasi specifiche del sito, catalizzano il movimento di sezioni di DNA tra siti definiti che condividono alcunesequenze omologhe. Quando si verificano movimenti come questi, le regioni da scambiare sono tipicamente affiancate da una coppia di sequenze simmetriche comprese di DNA a doppio filamento lungo da circa 20 a 30 coppie di basi. gli enzimi specializzati, chiamati ricombinasi, che si legano a queste sequenze possono appartenere a famiglie di ricombinasi serina o tirosina.Le famiglie hanno o un residuo di serina o di tirosina al sito attivo dell’enzima, ed impiegano meccanismi distinti. Nel caso della serina ricombinasi, le subunità si legano in primo luogo specificamente alle loro nuove sequenze di riconoscimento, formanti un complesso sinaptico. allora, la serina attiva del sito, attacca il DNA della struttura del fosfodiestere, al centro di queste sequenze che generano i punti di rottura conosciuti come siti di crossover.Successivamente, le ricombinasi serine taglieranno tutte le eliche del DNA coinvolte prima che lo scambio del filamento proceda. Al contrario, le ricombinasi tirosiniche legano nello stesso modo, ma tagliano e uniscono un filamento del DNA duplex alla volta. Il residuo di tirosina poi covalentemente lega con le tre estremità primarie del filamento segmentato, mentre i cinque gruppi liberi di ossidrile primario attaccano il legame proteico di DNA formando un intermedio di Holliday.Questo pattern complesso è il primo evento crossover;allora, quando i rimanenti filamenti di DNA sono scissi e scambiati dalle subunità di ricombinasi nel secondo evento, la giunzione di Holliday è risolta ai prodotti ricombinanti. Ci sono tre risultati potenziali di eventi di ricombinazione come questi. Il primo, è l’integrazione in cui una molecola di DNA circolare viene inserita in un secondo DNA lineare.Quando entrambi i siti si trovano sulla stessa molecola di DNA, il secondo risultato potrebbe essere l’escissione, dove la parte del DNA ritagliata è semplicemente rimossa, liberi di integrarsi altrove nel genoma. Nel terzo scenario, se i siti di incisione sono in orientamenti opposti, l’inversione può verificarsi quando la sezione di DNA viene rimossa e poi reintegrata nell’orientamento opposto. Un esempio ben studiato di questo fenomeno è l’inversione sito-specifica di un segmento cromosomico del batterio salmonella, che gli permette di produrre due diversi tipi di proteine 00:02 44.720-00:02:47.700 flagelline a seconda dell’ambiente;e questo processo è chiamato variazione di fase.

7.16:

Ricombinazione conservativa sito-specifica e variazione di fase

Because the DNA segments are cut and reorganized in a direction-specific manner, site-specific recombination has emerged as an efficient genetic engineering technique. Flippase and Cyclization recombinases or Flp and Cre, respectively, are two members of the tyrosine recombinase family derived from bacteriophages, that are used to mediate site-specific DNA insertions, deletions, and targeted expression of proteins in mammalian cell lines.

The recognition sites for Cre recombinase called LoxP sites are around 34 basepairs in length. LoxP sites contain 13 bp palindromic sequences, meaning that the nucleotide sequence reads the same in both 5’ to 3’ and 3’ to 5’ directions. Site-specific recombination mediated by Cre recombinases is one of the most popular methods used in the creation of transgenic mice with acquired mutations. Using thermostable variants of Cre recombinase with tissue specific promoters allows for spatial control over Cre recombinase's expression and action. For instance, placing a kidney-specific Cadherin promoter upstream of the Cre gene allows the enzyme to be expressed only in renal tissues. For temporal control of Cre recombinase activity, the enzyme gene is fused with a ligand binding domain so that the enzyme is expressed only in the specific ligand’s presence.

A major limitation in using site-specific recombination as a genome editing tool is that the recombination target site or sites must be first inserted or must be present by chance. If a genomic site congruent with the enzyme recognition site can be preselected, the recombinases can be used with “made-to-order” target specificity. Recent studies have used mutagenesis and gene shuffling to design Flp variants that can functionally recognize sites with combinatorial mutations. The results are promising for future iterations of gene shuffling that can yield more specific Flp variants and can be used commercially as a molecular tool for engineering large genomes.

Suggested Reading

  1. Yang, Wei. "Topoisomerases and site-specific recombinases: similarities in structure and mechanism." Critical reviews in biochemistry and molecular biology 45, no. 6 (2010): 520-534.
  2. Xiong, Ling, Xiaole L. Chen, Hannah R. Silver, Noreen T. Ahmed, and Erica S. Johnson. "Deficient SUMO attachment to Flp recombinase leads to homologous recombination-dependent hyperamplification of the yeast 2 μm circle plasmid." Molecular biology of the cell 20, no. 4 (2009): 1241-1251.