Back to chapter

7.16:

اعادة تركيب محدد بالمواقع المحافظة و اختلاف الاطوار

JoVE Core
Molecular Biology
This content is Free Access.
JoVE Core Molecular Biology
Conservative Site-specific Recombination and Phase Variation

Languages

Share

التهجين المحدد بالموقع هو نوع من التبادل الجيني حيث إنزيمات متخصصة تسمى ريكومباينازيس المحددة بالموقع تحفز حركة أجزاء دى إن إيه بين المواقع المحددة التي تشترك في بعض التسلسل المتماثل عندما تحدث مثل هذه التحركات المناطق التي سيتم تبادلها عادة تكون محاطة بزوج من متسلسلات متماثلة مكونة 00:00:23.430 00:00:28.760 من دى إن إيه المزدوج الشريط حوالي 20 إلى 30 زوجًقواعد فى الطول 00:00:28.760 00:00:31.520 الأنزيمات المتخصصة تسمى انزيمات التهجين(ريكومبينازيس)التي ترتبط بهذه التسلسلات تنتمى لعائلات التهجين سيرين أو التيروزين. هذه العائلات لديها إما جزيئات سيرين أو تيروزين 00:00:41.210 00:00:43.230 في الموقع النشط فى الانزيم وتوظف آليات متميزة. في حالة تهجين السيرين الوحدات الفرعية أولاًتحديدا ترتبط بتسلسلات التمييز الجديدة مكونا مركب متشابك.بعد ذلك موقع سيرين النشط يهاجم البنية الأساسية لل دى إن أيه فوسفوداي استر في مركز هذه التسلسلات لتنشأ بذلك نقاط كسر معروفة باسم مواقع التقاطع بعد ذلك انزيم السيرين ريكموبايناز سيقطع كل حلزونات دي ان ايه المشاركة قبل بدء بتبادل الشريط على العكس انزيم التيروزين الريكومبيناز يرتبط بنفس الاسلوب،لكن قطع و وصل شريط واحد من الحمض النووي المزدوج علي حدي. جزيئات التيروزين بعد ذلك ترتبط تساهميًا بنهاية 3 فى الشريط المشقوق بينما مجموعات هيدروكسيل الحرة فى النهاية 5 هاجمت رابطة بروتين الدى إن إيه مشكلا تقاطع هوليداى الوسطية. هذا النمط المعقد أول حدث تداخل.ثم عندما شرائط الدي ان ايه المتبقية يتم شقها و تبادلها بواسطة الوحدات التهجين الفرعية في الحدث الثاني تقاطع هوليداى تتحلل لمنتجات المهجنة. هناك ثلاثة نتائج محتملة من مثل احداث التهجين هذه الأول هو الاندماج حيث فيه جزيء الدي ان ايه الدائري يتم إدخاله في دي ان ايه خطي ثاني. 00:02:07.780 00:02:10.960 عندما يكون كلا الموقعين على نفس جزيء الدي ان ايه النتيجة الثانية قد يكون الاستئصال حيث جزء من قطع الدي ان ايه أزيلت ببساطة 00:02:16.960 00:02:20.230 حرة الاندماج في مكان آخر في الجينوم.في السيناريو الثالث إذا كانت مواقع القطع في الاتجاه المعاكس يمكن أن يحدث إنعكاس حيث ان قطعة الدي ان اي تتم إزالتها ثم تعاد دمجها في الاتجاه المعاكس مثال مدروس جيدا لهذه الظاهرة هو إنعكاس محدد بالموقع لجزء كروموسومي من بكتيريا السالمونيلا, التى تسمح لها بإنتاج نوعين مختلفين من بروتين الفلاجيلين اعتمادا على على البيئة. وهذه العملية تسمى اختلاف المرحلة.

7.16:

اعادة تركيب محدد بالمواقع المحافظة و اختلاف الاطوار

نظراً لأنه يتم قطع أجزاء الحمض النووي وإعادة تنظيمها بطريقة محددة الاتجاه، فقد ظهرت إعادة التركيب الخاصة بالموقع كطريقة فعالة للهندسة الوراثية. إعادة اتحاد فليباز و التشكيل الحلقي أو Flp و Cre، على التوالي، هما عضوان في إنزيم التيروزين ريكومبيناز عائلة مشتقة من عاثيات البكتيريا، والتي تُستخدم للتوسط في عمليات إدخال الحمض النووي الخاصة بالموقع وحذفه والتعبير المستهدف للبروتينات في خطوط خلايا الثدييات.

يبلغ طول مواقع التعرف على ريكومبيناز Cre التي تسمى مواقع LoxP حوالي 34 زوجاً أساسياً. تحتوي مواقع LoxP على 13 تسلسلًا متناظراً قبل الميلاد، مما يعني أن تسلسل النوكليوتيدات يقرأ نفس الشيء في كل من الاتجاهات من 5&#8217؛ إلى 3&#8217؛ ومن 3&#8217؛ إلى 5&#8217؛. تعد إعادة التركيب الخاصة بالموقع بوساطة إعادة التركيب المترابطة من أكثر الطرق شيوعاً المستخدمة في إنشاء الفئران المعدلة وراثياً ذات الطفرات المكتسبة. يسمح استخدام المتغيرات القابلة للحرارة من ريكومبيناز مع محفزات معينة للأنسجة بالتحكم المكاني في تعبير وأفعال Cre ريكومبيناز. على سبيل المثال، يسمح وضع محفز كادرين الخاص بالكلى في بداية جين Cre بالتعبير عن الإنزيم فقط في أنسجة الكلى. من أجل التحكم الزمني في نشاط إعادة التركيب الكيميائي لـ Cre، يتم دمج جين الإنزيم مع مجال ربط يجند بحيث يتم التعبير عن الإنزيم فقط في وجود ligand محدد.

يتمثل أحد القيود الرئيسية في استخدام إعادة التركيب الخاصة بالموقع كأداة لتعديل الجينوم في أنه يجب إدخال موقع أو مواقع هدف إعادة التركيب أولاً أو يجب أن تكون موجودة عن طريق الصدفة. إذا كان من الممكن تحديد موقع الجينوم المتطابق مع موقع التعرف على الإنزيم مسبقاً، فيمكن استخدام إعادة التركيب مع &#8220؛ حسب الطلب &#8221؛ الهدف المحدد. استخدمت الدراسات الحديثة الطفرات وخلط الجينات لتصميم متغيرات Flp التي يمكنها التعرف وظيفيًا على المواقع ذات الطفرات التوافقية. النتائج واعدة للتكرارات المستقبلية لخلط الجينات التي يمكن أن تسفر عن متغيرات Flp أكثر تحديداً ويمكن استخدامها تجارياً كأداة جزيئية لهندسة الجينومات الكبيرة.

Suggested Reading

  1. Yang, Wei. "Topoisomerases and site-specific recombinases: similarities in structure and mechanism." Critical reviews in biochemistry and molecular biology 45, no. 6 (2010): 520-534.
  2. Xiong, Ling, Xiaole L. Chen, Hannah R. Silver, Noreen T. Ahmed, and Erica S. Johnson. "Deficient SUMO attachment to Flp recombinase leads to homologous recombination-dependent hyperamplification of the yeast 2 μm circle plasmid." Molecular biology of the cell 20, no. 4 (2009): 1241-1251.