Back to chapter

7.16:

Konservatif Alan-spesifik Rekombinasyon ve Faz Varyasyonu

JoVE Core
Molecular Biology
This content is Free Access.
JoVE Core Molecular Biology
Conservative Site-specific Recombination and Phase Variation

Languages

Share

Bölgeye özgü rekombinasyon, bölgeye özgü rekombinazlar olarak adlandırılan özelleşmiş enzimlerin, DNA bölümlerinin bazı dizi homolojisini paylaşan tanımlanmış bölgeler arasında hareketini katalize ettiği bir genetik değiştirim tipidir. Bu gibi hareketler meydana geldiğinde, değiştirilecek bölgeler genellikle, yaklaşık 20 ila 30 baz çifti uzunlukta çift zincirli DNA’dan oluşan bir çift simetrik dizi ile çevrelenir. Bu dizilere bağlanan ve rekombinaz adı verilen özelleşmiş enzimler, serin veya tirozin rekombinaz ailelerine ait olabilir.Bu ailelerde, enzimin aktif yerinde bir serin veya tirozin rezidüsü vardır ve farklı mekanizmalar kullanırlar. Serin rekombinaz durumunda, alt birimler öncelikle yeni tanıma dizilerine bağlanarak sinaptik bir kompleks oluştururlar. Daha sonra, aktif yerdeki serin, bu dizilerin merkezindeki fosfodiester DNA omurgasına saldırır ve çapraz-geçiş bölgeleri olarak bilinen kırılma noktaları oluşturur.Ardından, serin rekombinazları, ilgili tüm DNA sarmallarını keser ve zincir değiştirimi devam eder. Buna karşılık, tirozin rekombinazları da aynı şekilde bağlanır;ancak bir seferde DNA dubleksinin sadece bir zincirini kesip birleştirir. Tirozin rezidüsü daha sonra kesilen zincirin 3’ucuna kovalent olarak bağlanırken, serbest 5’hidroksil grubu, protein DNA bağına saldırarak bir Holliday kavşağı ara ürünü oluşturur.Bu karmaşık model, ilk çapraz-geçiş olaydır. Daha sonra, kalan DNA zincirleri ikinci olayda rekombinoz alt birimleri tarafından bölünüp karşılıklı değiştirildiğinde, Holliday kavşağı rekombinant ürünlere ayrılır. Bunun gibi rekombinasyon olaylarının üç olası sonucu vardır.Birincisi, dairesel bir DNA molekülünün ikinci bir doğrusal DNA’ya yerleştirildiği entegrasyondur Her iki bölge de aynı DNA molekülünde olduğunda, ikinci sonuç olan eksizyon gerçekleşebilir;burada DNA’nın kesilip alınan kısmı genomun başka bir yeriyle birleşmekte özgürdür. Üçüncü senaryoda, kesi bölgeleri zıt yönelimlerdeyse, inversiyon yani DNA parçasının çıkarıldıktan sonra ters yönelimde yeniden eklenmesi gerçekleşebilir. Bu olayın iyi çalışılmış bir örneği, bakteri salmonellasındaki bir kromozom segmentinin bölgeye özgü inversiyonudur;bu işlem, çevreye bağlı olarak iki farklı protein flagellin tipi üretmesine olanak sağlar.Ve bu prosese faz varyasyonu denir.

7.16:

Konservatif Alan-spesifik Rekombinasyon ve Faz Varyasyonu

DNA segmentleri yöne özel bir şekilde kesilip yeniden düzenlendiğinden, bölgeye özgü rekombinasyon, etkili bir genetik mühendisliği tekniği olarak ortaya çıktı. Flippase ve Cyclization rekombinazları veya sırasıyla Flp ve Cre, bakteriyofajlardan türetilen tirozin rekombinaz ailesinin iki üyesidir ve memeli hücre hatlarında bölgeye özgü DNA insersiyonuna, silmelerine ve proteinlerin hedeflenmiş ekspresyonuna aracılık etmek için kullanılır.

LoxP siteleri olarak adlandırılan Cre rekombinaz için tanıma bölgeleri, yaklaşık 34 baz çifti uzunluğundadır. LoxP siteleri 13 bp palindromik sekans içerir, bu da nükleotid sekansının aynı şeyi hem 5'‘ten 3'‘e ve 3'‘ten 5'‘e yönünde okuması anlamına gelir. Cre rekombinazlarının aracılık ettiği bölgeye özgü rekombinasyon, edinilmiş mutasyonlara sahip transgenik farelerin yaratılmasında kullanılan en popüler yöntemlerden biridir. Cre rekombinazın ısıya dayanıklı varyantlarının dokuya özgü promoterler ile kullanılması, Cre rekombinaz ekspresyonu ve eylemi üzerinde uzamsal kontrole izin verir. Örneğin, böbreğe özgü bir Kadherin promotörünün Cre geninin yukarı akışına yerleştirilmesi, enzimin yalnızca böbrek dokularında eksprese edilmesine izin verir. Cre rekombinaz aktivitesinin zamansal kontrolü için, enzim geni bir ligand bağlama alanı ile kaynaştırılır, böylece enzim yalnızca spesifik ligand varlığında eksprese edilir.

Bir genom düzenleme aracı olarak bölgeye özgü rekombinasyonun kullanılmasındaki önemli bir sınırlama, rekombinasyon hedef sitesinin veya sitelerinin ilk önce eklenmesi veya şans eseri mevcut olması gerektiğidir. Enzim tanıma sahası ile uyumlu bir genomik bölge önceden seçilebiliyorsa, rekombinazlar “ siparişe göre ” yapılan hedef özgüllük ile kullanılabilir. Son çalışmalar, kombinatoryal mutasyonlara sahip bölgeleri işlevsel olarak tanıyabilen Flp varyantlarını tasarlamak için mutagenez ve gen karıştırmayı kullanmıştır. Sonuçlar, daha spesifik Flp varyantları sağlayabilen ve ticari olarak büyük genomların mühendisliğinde moleküler bir araç olarak kullanılabilen gelecekteki gen karıştırma yinelemeleri için umut vericidir.

Suggested Reading

  1. Yang, Wei. "Topoisomerases and site-specific recombinases: similarities in structure and mechanism." Critical reviews in biochemistry and molecular biology 45, no. 6 (2010): 520-534.
  2. Xiong, Ling, Xiaole L. Chen, Hannah R. Silver, Noreen T. Ahmed, and Erica S. Johnson. "Deficient SUMO attachment to Flp recombinase leads to homologous recombination-dependent hyperamplification of the yeast 2 μm circle plasmid." Molecular biology of the cell 20, no. 4 (2009): 1241-1251.