फैब्रिकेशन और पक्षपाती सेलुलर संस्कृति के लिए एक ऑक्सीजन सम्मिलित ऑपरेशन

Summary

और कि 6 अच्छी तरह से एक थाली में स्थानिक और लौकिक oxygenation से अधिक बढ़ाया नियंत्रण प्रदान करता है एक मंच पर जोड़ने के निर्माण की मान्यता. डिवाइस संस्कृति प्रणालियों के एक नंबर करने के लिए अनुकूल है और घाव भरने पर ऑक्सीजन के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

आक्सीजन कई सेलुलर रास्ते की एक महत्वपूर्ण न्यूनाधिक है, लेकिन मौजूदा उपकरणों की अनुमति<em> इन विट्रो में</em> ऑक्सीजन मॉडुलन के लिए जैव चिकित्सा अनुसंधान की जरूरतों को पूरा करने में विफल. hypoxic कक्ष मानक संस्कृति वाहिकाओं में oxygenation को नियंत्रित करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करता है, लेकिन कोशिका की सतह पर ऑक्सीजन एकाग्रता पर सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण का अभाव है, शारीरिक घटना के एक किस्म अध्ययन में अपने आवेदन को रोकने. Hypoxic कक्ष पर अन्य प्रणालियों में सुधार हुआ है, लेकिन विशेष ज्ञान और उनके संचालन के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है, औसत शोधकर्ता के लिए उन्हें डरा देता है. Multiwell प्लेटों के लिए एक microfabricated सम्मिलित करने के लिए और अधिक प्रभावी ढंग से बेहतर मॉडल शारीरिक पाया घटना को अस्थायी और स्थानिक ऑक्सीजन एकाग्रता को नियंत्रित करने के लिए विकसित किया गया है<em> Vivo में</em>. मंच polydimethylsiloxane डालने के होते हैं कि एक मानक multiwell थाली में घोंसले और एक गैस पारगम्य झिल्ली उद्देश्य के साथ एक निष्क्रिय microfluidic गैस नेटवर्क के रूप में कार्य करता है पक्षपाती कोशिकाओं को ऑक्सीजन प्रसव मिलाना. डिवाइस का उपयोग करने के लिए सरल है और गैस सिलेंडरों कि दबाव मंच में वांछित ऑक्सीजन एकाग्रता का परिचय प्रदान करने के लिए जुड़ा हुआ है. निर्माण मानक photolithography SU 8, प्रतिकृति मोल्डिंग, और परिभाषित PDMS एक सिलिकॉन वफ़र पर कताई का एक संयोजन शामिल है. डिवाइस के घटकों सतह हाथ से आयोजित एक प्लाज्मा प्रणाली का उपयोग कर उपचार के बाद बंधुआ हैं. मान्यकरण एक planar फ्लोरिसेंट ऑक्सीजन सेंसर के साथ पूरा किया है. संतुलन समय मिनट के आदेश पर है और ऑक्सीजन प्रोफाइल की एक विस्तृत विविधता चक्रीय इस अध्ययन में हासिल की प्रोफ़ाइल जैसे डिवाइस डिजाइन, और यहां तक ​​कि ऑक्सीजन gradients के आधार पर प्राप्त किया जा सकता है पाया उन नकल<em> Vivo में</em>. डिवाइस सेल संस्कृति के लिए निष्फल समारोह के नुकसान के बिना आम तरीकों का उपयोग किया जा सकता है. डिवाइस का अध्ययन करने के लिए प्रयोज्यता<em> इन विट्रो में</em> घाव भरने प्रतिक्रिया का प्रदर्शन किया जाएगा.

Protocol

1. डिवाइस समारोह hypoxic डालने डिवाइस 6 स्तंभों में शामिल है कि एक मानक 6 अच्छी तरह से थाली में घोंसला. गैस स्तंभ में बहती है, स्तंभ के आधार पर एक microfluidic नेटवर्क के पार, और वापस डिवाइस के बाहर बहती है. Microchannel के नीचे दीवार बनाने स्तंभ के आधार पर एक 100 सुक्ष्ममापी मोटी गैस पारगम्य PDMS झिल्ली है कि microchannel गैस और संस्कृति मीडिया के बीच ऑक्सीजन प्रसार परमिट है. इस प्रकार, इस डिवाइस एक एकाग्रता ढाल है कि एक वांछित मूल्य की दिशा में मीडिया ऑक्सीजन एकाग्रता ड्राइव स्थापित द्वारा संचालित है. डिवाइस hypoxic कक्ष और अन्य सेल oxygenation प्रणालियों से अधिक लाभ का एक नंबर प्रदान करता है: 1) ऑक्सीजन प्रसार तेजी से अस्थायी नियंत्रण, 2 की अनुमति पथ कम से कम) oxygenation पर स्थानिक नियंत्रण, के रूप में स्तंभ microchannel डिजाइन, 3 पर निर्भर) को बढ़ाता है एक पास प्रयोगशाला छोटे पदचिह्न और उच्च प्रायोगिक दक्षता बढ़ाने के लिए throughput के, और 4) विशेष ज्ञान और उपकरणों के लिए आवश्यकता के बिना आम सेल संस्कृति उपकरण (जैसे multiwell थाली) के लिए adapts. 2. उपकरण निर्माण पहले स्तंभ सरणी प्रतिकृति PDMS के साथ एक पहले से machined Delran सांचे में ढाला है. गैस अगला प्रत्येक स्तंभ के नीचे microchannel मानक SU 8 और photolithography PDMS प्रतिकृति ढलाई का उपयोग करने के लिए गढ़े है. गैस पारगम्य झिल्ली एक सिलिकॉन वफ़र पर परिभाषित PDMS की कताई इच्छित मोटाई को प्राप्त करने के द्वारा गढ़े है. इस उदाहरण में हम एक 100 सुक्ष्ममापी मोटी झिल्ली जो 500 rpm 10 सेकंड के लिए और फिर 30 सेकंड के लिए 900 rpm कताई द्वारा निर्मित किया गया था का उपयोग करें. एक हाथ में प्लाज्मा डिवाइस (बी.डी. 20-मॉडल, इलेक्ट्रो Technic उत्पाद) के साथ ऑक्सीजन प्लाज्मा उपचार के बाद सभी घटकों को एक साथ बंधुआ रहे हैं. 3. डिवाइस सेटअप धीरे थाली में डिवाइस सम्मिलित करते हैं, बुलबुले से बचने सुनिश्चित करने. सम्मिलन के दौरान डिवाइस Angling बुलबुले बाहर निष्कासित एक तरफ करने में मदद करता है. वास्तविक सेल आधारित प्रयोगों के लिए, यह कदम एक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड के अंदर किया जाना चाहिए. प्रदूषण के लिए संभावना बहुत कम कर रहे हैं एक बार डिवाइस डाला जाता है, तो विधानसभा इनक्यूबेटर खत्म हो सकता है एक गैर बाँझ वातावरण में किया जाता है. स्रोत गैस टैंक से डिवाइस के बंदरगाहों के लिए Inlet और आउटलेट टयूबिंग कनेक्ट. सेल आधारित प्रयोगों के लिए, संस्कृति इनक्यूबेटर एक छेद करने के लिए टयूबिंग प्रविष्टि और टयूबिंग डिवाइस ले जाने और यह इनक्यूबेटर में रखने के बाद से जुड़ा होना चाहिए की अनुमति होनी चाहिए. डिवाइस है, जो पर्याप्त ख़राब PDMS अंतर्निहित कोशिकाओं को कुचलने पर अतिरिक्त दबाव डालने से बचने के लिए सावधान रहें. सुनिश्चित करें कि सटीक प्रवाह नियामक डिवाइस ढेर से बचने के टैंक शीर्ष नियामक खोलने से पहले बंद कर दिया है. गैस के प्रवाह को प्रारंभ करें. धीरे खुले सटीक प्रवाह वांछित प्रवाह की दर (5-10 एमएल / मिनट) के लिए नियामक. मूल्य बारीकी से अगले एक घंटे से अधिक और देखो समायोजन के रूप में की जरूरत बनाने के लिए, के बाद से दबाव ड्रॉप, जबकि प्रणाली equilibrates, प्रवाह दर में फेरबदल बदल जाएगा. मीडिया में बुलबुले के गठन से बचने के लिए, उच्च प्रवाह की दर के साथ एक प्रारंभिक 15 मिनट संतुलन की अवधि के बाद 10-20 के बीच एमएल / मिनट प्रवाह दर को कम करने. वांछित प्रयोगात्मक अवधि के बाद, गैस का प्रवाह बंद करो, थाली हटा, और प्रक्रिया कोशिकाओं के अनुसार (जैसे lyse, दाग, गिनती, आदि). 4. डिवाइस मान्यकरण अंशांकन फ्लोरिसेंट ऑक्सीजन पर और पदों की संख्या और स्थान का चयन करें (Foxy) सेंसर (सत्यापन की आवश्यकताओं पर निर्भर करता है) स्लाइड है कि ऑक्सीजन की माप के लिए इस्तेमाल किया जाएगा. स्लाइड एक फ्लोरोसेंट दयाता डाई कोटिंग है कि ऑक्सीजन द्वारा बुझती है शामिल हैं. 10 0, सीधे स्लाइड करने के बेनकाब, और गैस की टंकी से 21% ऑक्सीजन और उचित संतुलन के लिए 5 मिनट के बाद छवियों पर कब्जा. प्रत्येक और फ्लोरोसेंट तीव्रता पर निर्भर के रूप में भूखंड oxygenation एकाग्रता की स्थिति के लिए क्या मतलब छवि तीव्रता निर्यात. 0-10% की लाइन के लिए फिटिंग रैखिक घटता है और 10-21% लाइन द्वारा अंशांकन वक्र उत्पन्न करता है. विविधता एकाधिक एक परिभाषित अंतराल (जैसे हर 1 मिमी) पर चैनल की चौड़ाई फैले अंक की स्थापना. ध्यान दें कि रिक्ति के आधार पर छवियों के ओवरलैप हो सकता है. अच्छी तरह से सतह पर डिवाइस के माध्यम से ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने संतुलन Foxy स्लाइड पर तीन अंक में जो ऑक्सीजन एकाग्रता को मापने के लिए चुनें. ऑक्सीजन का स्तर परिवेश में पहली बार एक छवि पर कब्जा करने के तुरंत बाद, सटीक प्रवाह डिवाइस में गैस का प्रवाह शुरू नियामक खुला. एक उचित अंतराल पर छवियों पर कब्जा करने के लिए और ऑक्सीजन concentr की अवधि और सीमा का आकलनव्यावहारिक संतुलन (30 मिनट के लिए हर 10 सेकंड उदा). 5. अनुप्रयोगों घाव भरने प्रयोग से एक दिन पहले, सीरम मुक्त माध्यम में निष्फल PDMS डालने सोख को कम करने के लिए कुएं में गैस बुलबुला गठन को बाधित. 100% 6 अच्छी तरह से एक थाली में confluency संस्कृति कोशिकाओं. P200 विंदुक टिप घाव अनुकरण के साथ monolayers में सीधे खरोंच बनाएँ. सेल मीडिया Aspirate, 5 एमएल मीडिया के साथ, कुल्ला और फिर aspirate. यह महत्वपूर्ण है के लिए कक्षों की monolayer भंग नहीं. कुओं 4 एमएल सीरम मुक्त माध्यम सेल प्रसार को कम करने के साथ फिर से भरना. प्लेस कुओं में डालने और एक इसी ऑक्सीजन एकाग्रता के लिए एक अच्छी तरह से कनेक्ट. प्लेस 37 6 गरम मंच पर डालने के साथ अच्छी तरह से थाली डिग्री सेल्सियस इच्छित अंतराल और कुल अवधि पर समय कक्षों की चूक छवियों कैद करो. MATLAB T_Scratch, एक घाव मापने एल्गोरिथ्म, unhealed सतह क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 6. प्रतिनिधि परिणाम डिवाइस सत्यापन hypoxic डालने डिवाइस ऑक्सीजन संतुलन और समय सीमा के मामले में hypoxic चैम्बर से अधिक महान सुधार दर्शाती है, कम से कम 2 मिनट की आवश्यकता करने के लिए 0.5% ऑक्सीजन स्थिर. डिवाइस झिल्ली अच्छी तरह से नीचे अंतराल आकार संतुलन दक्षता का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण कारक था, बड़े अंतराल के आकार और अधिक समय की आवश्यकता स्थिर राज्य ऑक्सीजन एकाग्रता मूल्यों तक पहुँचने के साथ. इस उपकरण में भी एक अच्छी तरह से एक में स्थानिक oxygenation पर नियंत्रण का एक बड़ा सौदा परमिट, एकाधिक शर्तों के गठन की अनुमति है, और भी अच्छी तरह से की सतह भर में एक चक्रीय ऑक्सीजन प्रोफ़ाइल पैदा. घाव भरने सेल monolayers 10% या 21% ऑक्सीजन और घाव की सतह क्षेत्र को उजागर किया गया समय पर विश्लेषण किया गया था. 21% ऑक्सीजन को उजागर खरोंच धीमी और 10% तेजी से बंद कर दिया. चित्रा 1 17 घंटे के कोर्स पर एक खरोंच की छवियों से पता चलता है. चित्रा 5 में रेखांकन प्रयोग की अवधि के लिए दोनों ऑक्सीजन सांद्रता के लिए खुले घाव क्षेत्र के प्रतिशत दिखा. चित्रा 1 योजनाबद्ध और डिवाइस सुविधाओं illustrating आरेख. ऑक्सीजन डालने डिवाइस पारंपरिक photolithography (microfluidic नेटवर्क), प्रतिकृति ढलाई (microfluidic नेटवर्क और डालने पाड़) द्वारा गढ़े है, और परिभाषित PDMS की कताई (गैस पारगम्य झिल्ली). ए) ऑक्सीजन डिवाइस 6 अच्छी तरह से एक थाली में नीडिंत. बी) 24 और 96 अच्छी तरह से स्तंभ सरणियों के उदाहरण. सी) एक स्तंभ का एक योजनाबद्ध पार के अनुभागीय. आक्सीजन डिवाइस में प्रवेश के माध्यम से बहती है और स्तंभ के नीचे स्थित एक microfluidic नेटवर्क भर में यात्रा है. आक्सीजन गैस पारगम्य PDMS झिल्ली भर में स्वतंत्र रूप से स्तंभ के नीचे फैलाना कर सकते हैं और संस्कृति मीडिया में भंग. डी) एक माइक्रोस्कोप छवि एकल चैनल ऊपर से एक स्तंभ के विभिन्न सुविधाओं बंधुआ संतुलन अध्ययन के लिए कांच के पदों के साथ, दिखा रहा है. चित्रा 2 ऑक्सीजन सेंसर के साथ युक्ति के मान्यकरण. प्रत्येक अच्छी तरह के भीतर ऑक्सीजन तनाव एक planar दयाता ऑक्सीजन सेंसर का उपयोग विशेषता थी. सभी ऑक्सीजन मिश्रण मीडिया बफरिंग के लिए संतुलित नाइट्रोजन और 5% सीओ 2 होता है . ए) प्लॉट पोस्ट ऊंचाई के प्रभाव illustrating, और झिल्ली और कोशिकाओं के बीच इस प्रकार ऑक्सीजन प्रसार दूरी संतुलन समय और प्रभावशीलता पर. हाइट्स कट ग्लास डिवाइस के नीचे करने के लिए बाध्य पोस्ट स्थापित किए गए थे. सभी तीन पद आकार उपज संतुलन बार ज्यादा hypoxic चैम्बर से अधिक सुधार हुआ है. ध्यान दें कि समय एक लॉग पैमाने पर है. बी) प्लॉट 0.2 मिमी अंतराल डिवाइस के तेजी से ऑक्सीजन संतुलन प्रतिक्रिया समय चित्रण. सी) की स्थिति मल्टी linescans भी microchannel के तहत किया गया अच्छी तरह से भर लिया ऑक्सीजन डिवाइस के द्वारा शुरू की एकाग्रता की एकरूपता सुनिश्चित करने. 0%, 10%, और 10 मिनट के लिए 21% ऑक्सीजन infusing के बाद मापा ग्राफ़ ऑक्सीजन एकाग्रता दर्शाया गया है. डी) डिवाइस प्रभावी ढंग से 5 दिनों में 10% ऑक्सीजन का कहना है. चित्रा 3 ऑक्सीजन microchannel डिजाइन और अधिक जटिल के साथ प्रयोग. ए) microchannel दोहरी हालत सेटअप एक स्थिर 0% और 21% 14 दिनों से अधिक ऑक्सीजन प्रोफ़ाइल पैदावार. बी) 500 सुक्ष्ममापी चौड़ाई microchannels की एक interdigitated और घुमावदार पैटर्न वें भर का विस्तारई एक चक्रीय ऑक्सीजन प्रोफ़ाइल में स्तंभ परिणाम है. ध्यान दें कि डेटा केवल एक प्रतिनिधि परीक्षण दर्शाया गया है microchannel संरेखण के रूप में मुश्किल था. चित्रा 4 घाव बंद 0, 7, और प्रारंभिक खरोंच के बाद 17 घंटे के timelapse छवियाँ. कक्ष प्रयोग की अवधि के दौरान 21% ऑक्सीजन दिया गया. 5 चित्रा एक खरोंच परख में घाव चिकित्सा दर पर ऑक्सीजन एकाग्रता के प्रभाव.

Discussion

मानक photolithography SU 8, प्रतिकृति मोल्डिंग, और परिभाषित कताई और polydimethylsiloxane पूरी तरह से बनाया डिवाइस के द्वारा गढ़े है. गैस डिवाइस में पेश किया है microchannel स्तंभ और संस्कृति मीडिया के बीच एक एकाग्रता ढाल स्थापित, सिस्टम एक वांछित संतुलन ऑक्सीजन एकाग्रता की ओर ड्राइविंग. युक्ति को प्रभावी ढंग से एक अच्छी तरह से अंदर अस्थायी और स्थानिक oxygenation मिलाना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेलुलर व्यवहार मिलाना उचित दिखाया गया है. oxygenation के स्थानिक patterning microchannel स्तंभ के आधार पर परिभाषित किया गया है, तो डिजाइन की एक किस्म photomask क्राफ्टिंग में लागू किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, वांछित गैस की अच्छी तरह से गैस चरण में जलसेक संतुलन समय और hypoxia की हद तक सुधार की उम्मीद है. एक microfluidic मिश्रण नेटवर्क डिवाइस के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए एक साधन प्रदान करने के लिए केवल कुछ स्टॉक गैस टैंक से उपन्यास गैस के मिश्रण का उत्पादन. अंत में, मीडिया के आदान प्रदान के लिए एक तंत्र डिवाइस के multiwell थाली, जो की कोशिकाओं को जवाब हो सकता है से हटाने के लिए की आवश्यकता को समाप्त होगा.

युक्ति किसी में इन विट्रो या पूर्व vivo ऑक्सीजन एकाग्रता पर नियंत्रण की आवश्यकता होती है प्रयोग में आवेदन किया है. के रूप में ऑक्सीजन एक महत्वपूर्ण शारीरिक चर संकेत दे रास्ते की एक विशाल बहुमत को प्रभावित है, अनुसंधान के क्षेत्रों में है कि लाभ होगा शोधकर्ता की रचनात्मकता द्वारा सीमित है. कुछ क्षेत्रों है कि ऑक्सीजन एकाग्रता बढ़ाया अस्थायी नियंत्रण से लाभ होगा कैंसर मेटास्टेसिस, सो apnea, और कई अन्य लोगों के अलावा हृदय ischemia reperfusion चोट, शामिल हैं. उदाहरण के लिए, आंतरायिक hypoxia के अधिक आक्रामक कैंसर के साथ सहसंबद्ध किया गया है, metastastis जुड़े जीन की संख्या निरंतर hypoxia और normoxia के सापेक्ष upregulating. स्थानिक नियंत्रण भी महत्वपूर्ण है, के रूप में ऑक्सीजन gradients के विकास, जिगर zonation, दवा विषाक्तता, और स्टेम सेल आला में महत्वपूर्ण हैं. इस लेख में प्रस्तुत डिवाइस एक छोटे प्रयोगशाला पदचिह्न, अपेक्षाकृत सरल संचालन आवश्यकताओं, और ऑक्सीजन कोशिकाओं को जोखिम पर अभी तक अधिक से अधिक नियंत्रण के साथ एक प्रणाली प्रदान करके अनुसंधान के क्षेत्रों के एक संख्या में लाभ होगा.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513