为贴壁细胞培养的氧气插入的制备及操作

Summary

制造和验证一个附加的平台，在空间和时间在6孔板充氧提供增强的控制。该设备是适应了文化系统，可用于调查的氧气对伤口愈合的影响。

Abstract

氧气是许多细胞途径的关键调制器，但目前的设备允许<em>在体外</em>氧气调制失败，以满足生物医学研究的需要。低氧室提供了一个简单的系统，以控制在标准的文化船只充氧，但缺乏精确的时间和空间，在细胞表面的氧气浓度控制，防止各种生理现象的研究及其应用。其他系统改善缺氧室，但其运作需要专门的知识和设备，使他们平均研究员恐吓。一个微型插入多孔板已经开发更有效地控制时间和空间的氧气浓度，以更好的模型发现的生理现象<em>在体内</em>。该平台由一个聚硅氧烷插入巢成一个标准的多孔板和被动的旨在气体渗透膜的微流控燃气管网供应，调节氧气输送到贴壁细胞。该设备使用简单，连接到提供的压力引入到平台所需的氧气浓度的气瓶。制造涉及到一个标准的SU – 8光刻，副本成型，并在硅片上的旋转定义的PDMS组合。保税后的表面，使用手持式等离子系统治疗设备的组成部分。验证是通过平面荧光灯的氧传感器。平衡时间是为了分钟的氧气型材多种，可以实现基于设备的设计，如在这项研究中所取得的循环轮廓，甚至氧梯度模仿这些发现<em>在体内</em>。该设备可消毒细胞培养，使用常用的方法，而不丧失功能。该设备的适用性研究<em>在体外</em将展示>伤口愈合反应。

Protocol

1。设备功能缺氧插入装置包含6个支柱，窝成一个标准的6孔板。气体流量为支柱，横跨在微流体网络的支柱基地，并流出设备的后面。在基地的底壁形成的微的支柱，是一个100微米厚的透气性PDMS膜，允许氧气扩散之间的气体微和文化传媒。因此，该器件通过建立所需的值，驱动器对媒体的氧气浓度的浓度梯度。 该器件提供一个缺氧室和其他细胞充氧系统的优点：1）最大限度地减少了氧的扩散路径，允许更快的时间控制，2）提高超过充氧的空间控制，依赖的支柱微设计，3）拥有实验室占地面积较小，以提高实验效率和更高的吞吐量，以及4）适应常见的细胞培养工具（如多孔板），没有专门知识和设备的要求。 2。设备制造第一支柱阵列与PDMS的，在以前的加工Delran模具成型的副本。 下一步气体微在每个支柱的底部是采用标准的SU – 8的光刻和PDMS副本成型。 透气膜制作在硅片上的PDMS的定义纺纱，以达到所需的厚度。在这个例子中，我们使用一个100微米厚的膜，这是由旋转500转10秒，30秒900转捏造。 所有组件粘合在一起的设备（BD – 20型，电技术学校产品）与手持式等离子氧等离子体处理后。 3。设备设置轻轻插入设备入板，一定要避免气泡。垂钓过程中插入的设备，有助于驱逐气泡的一面。对于实际的细胞为基础的实验，这一步必须做的无菌层流罩内。一旦设备被插入污染的机会大大减少，因此可以进行大会在非无菌环境中的孵化器。 从源头上煤气罐连接管设备的进口和出口。基于细胞的实验中，文化的孵化器应该有一个洞，允许管的入口和油管应携带该设备后，放入孵化器的连接。要小心，以避免在设备上，可变形的PDMS足以粉碎底层细胞多余的压力。 确保精密流量调节器关闭前开舱的最高监管机构，以避免溢出设备。启动气流量。轻轻打开精密流量调节到所需的流速（50-100毫升/分钟）。在接下来的一个小时密切注视值，并根据需要进行调整，因为压降会改变系统达到平衡，改变流速。为了避免在媒体中的气泡的形成，降低流速10-20毫升/分之间，具有较高的流量在经过最初的15分钟平衡时间。 所需的实验持续时间后，停气流量，取出盘子，和相应的处理细胞（如裂解，染色，计数等）。 4。设备验证 校准 选择的职位的数量和位置上的荧光氧 （FOXY）传感器幻灯片（根据审定要求），将使用氧气测量。幻灯片包含一个荧光钌染料涂层是由氧淬火。 公开幻灯片直接为0，10，21％从煤气罐的氧气和适当的平衡5分钟后捕获的图​​像。 出口依赖的荧光强度为每个位置和情节氧合浓度平均图像强度。 生成校准曲线线性曲线拟合的0-10％和10-21％的线路。 异质性 建立多点，横跨在定义的时间间隔（例如每1毫米）的通道宽度。请注意可能存在的间距取决于图像的重叠。 通过设备的氧气浓度测量以及表面 平衡 FOXY幻灯片上选择三个点来衡量的氧气浓度。 后的第一个图像捕捉周围的氧含量，立即打开精密流量调节器，开始进入设备的气体流量。在适当的时间间隔捕获的图像，以评估氧气concentr的时间长短和程度ATION平衡（如30分钟，每10秒）。 5。应用 伤口愈合 实验前的一天，浸泡在无血清培养基灭菌的PDMS的插入，以减少抑制天然气井的泡沫形成。 培养细胞至100％，在6孔板汇合。 建立与P200枪头来模拟伤口的单层直线划痕。 吸出细胞介质，用5 mL媒体冲洗，并吸一次。重要的是不要扰乱细胞单层。 笔芯的井4毫升的无血清培养基，降低细胞增殖。 插入井，每口井，并连接到相应的氧气浓度。 放置6孔板在37 ° C加热阶段的插入捕捉时间的推移细胞图像所需的时间间隔和总工期。 MATLAB的T_Scratch，伤口测量算法，可用于分析不愈的表面积。 6。代表性的成果 设备验证 缺氧插入设备表现出了很大的改善，对氧平衡时间和程度的低氧室需要不到2分钟，以稳定在0.5％的氧气。设备膜井底差距的大小决定平衡效率的关键因素，具有较大的差距，需要更多的时间来达到稳定状态的氧浓度值。该器件还允许一个很大的控制空间单井充氧，形成多个条件允许，甚至产生以及表面上的一个循环的氧气配置文件。 伤口愈合 随着时间的推移单层细胞暴露于10％或21％的氧气和表面积的伤口进行了分析。 21％的氧气接触到的划痕封闭最慢和最快的在10％。图1显示了一个超过17小时的过程中划伤的图像。图5中的图表显示了开放的伤口面积％的氧气浓度在实验期间。 图1说明设备功能的原理图和图。氧气插入设备制造由传统的光刻技术（微流控网络），副本成型（微流体网络和插入支架），并定义的PDMS纺纱（气体渗透膜）。一）嵌套到6孔板中的氧气设备。 B）24和96孔柱阵列的例子。 c）在一根柱子的截面示意图。氧流入的入口和设备，通过一个微网络上传播的支柱底部。整个透气PDMS膜，氧气可以自由地弥漫在支柱底部，并溶入培养基。 D）显微镜图像显示一个单通道的支柱，从上面的各种功能，保税平衡研究玻璃职位。 图2氧传感器设备的验证。以及在每个氧气张力的特点是使用一个平面的钌氧传感器。所有氧气混合物中的媒体缓冲平衡氮和5％的CO 2。 a）画出说明后高的效果，从而氧气的细胞膜和细胞之间的扩散距离，平衡时间和效益。高地建立了绑定到设备底部的玻璃切割职位。所有这三个职位大小产量平衡时间，大大改善了在低氧室。请注意，时间日志规模。二）情节描绘的0.2毫米的差距设备的快速氧平衡的响应时间。 c）多位置linescans还采取了根据微整个井，以确保同质化设备引进的氧气浓度。图描绘注入0％，10％和21％氧气10分钟后，测量氧浓度。四）设备有效地保持5天的10％以上的氧气。 图3更复杂的氧气微设计的实验。一）微双条件设置，产生一个稳定的0％和21％，超过14天的氧气的个人资料。 b）在500微米的宽度微叉和曲折的模式扩展到日在一个循环的氧气配置文件发送支柱结果。请注意该数据只描绘了一个有代表性的试验微对齐困难。 图4。Timelapse图像伤口缝合0，7，和17小时后最初从头。细胞交付整个实验持续时间21％的氧气。 图5。伤口愈合率在从头检测氧气浓度的影响。

Discussion

设备制造标准的SU – 8光刻，副本成型，并定义了纺纱和完全的聚二甲基硅氧烷。天然气是引进设备，建立了微支柱和文化传媒之间的浓度梯度，驾驶系统，对所需的平衡氧浓度。该设备已被证明能够有效调节的时间和空间内做好充氧，以及调节细胞行为适当。充氧的空间图案是由微定义在基地的支柱，因此，可以在制定光罩实施各种设计。此外，输液所需的气体进入井气相有望改善平衡时间和缺氧的程度。微流体混合网络可以适应的设备，提供了一种方法，只有少数股票煤气罐生产新型气体混合物。最后，媒体交流的机制将消除从多孔板，其中的细胞的反应可能需要删除该设备。

该设备已在体外或体外实验需要控制氧气浓度任何应用程序。由于氧气是一个重要的生理的变量影响的信号转导通路的绝大多数，是有限的研究领域，这将有利于创造力的研究员。这将有利于提高氧气浓度的时间控制的一些领域，包括癌细胞转移，睡眠呼吸暂停，并在许多其他的心肌缺血再灌注损伤。例如，间歇性低氧已与更多的浸润性癌，上调的metastastis相关基因的数量相对持续的低氧和常氧。空间的控制也很重要，因为氧气梯度发展，肝功能区划，药物的毒性，和干细胞小生境的关键。本文介绍的设备，将有利于通过提供实验室占地面积较小的，相对简单的操作要求，并大大增加细胞对氧接触到控制系统的研究领域。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
PDMS-Sylgard 184		Dow Corning
Planar FOXY sensor		Ocean Optics	FOXY-SGS-M	Coated microscope slide
Gas regulator		Omega	FL-1472-G
Gas		Airgas	Custom mixes	All have 5% CO2
SU-8 2150		Microchem
MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine		SAFC Biosciences	M3803
Fetal Bovine Serum		ATCC	30-2020
Trypsin-EDTA		Sigma	T4049
L-Glutamine solution		Sigma	G7513