在这里,我们提出的全基因组的不同在一个组蛋白结合结构域的蛋白异构体的位置分析染色质免疫沉淀(ChIP)的过程。我们把它应用到芯片的SEQ分析,以确定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的目标。
招聘转录和表观遗传因素对他们的目标是在调控的关键一步。突出在招聘绑定到特定的组蛋白修饰的蛋白结构域。这样一个领域是植物同源结构域(PHD),发现在几个染色质结合蛋白。后生因素RBP2多PHD域,然而,他们具有不同的功能(图4)。特别是,C -末端PHD域,发现在RBP2在人类白血病的致癌融合,结合,以三甲基赖氨酸4组蛋白H3(H3K4me3)1 。相应的谈话内容RBP2亚型,含有C -末端PHD promonocytic,淋巴瘤衍生成单核细胞 2,U937细胞分化过程中积累。这两组数据相一致,全基因组分析显示,在已分化的U937细胞,RBP2蛋白质获取本地化H3K4me3 3高度浓缩的基因组区域。 RBP2组蛋白去甲基化酶活性和转录活性的下降,由于减少在H3K4me3相关的RBP2其目标定位。相比之下,两个其他博士RBP2无法绑定H3K4me3。值得注意的是,RBP2的C端结构域博士是在较小的RBP2亚型4缺席。可以想象的是,RBP2小异构体,缺乏互动,与H3K4me3较大的异构体在基因组的位置不同。 RBP2亚型基因组的位置差异或许可以解释观察到的多样性RBP2功能。具体来说,RBP2是在视网膜母细胞瘤蛋白(PRB)介导的细胞分化的关键球员。与这些数据亚型之间没有区别,以前的全基因组分析,相一致,确定RBP2靶基因的两个不同的群体:1)由RBP2约束的方式,是独立的分化的基因; 2)绑定到RBP2基因分化依赖性。
为了确定本地化的异构体之间的差异,我们进行了全基因组的位置分析芯片序号。利用抗体检测RBP2我们已经找到所有RBP2目标亚型。此外,我们还只有绑定大,不小的RBP2异构体(图4)的抗体。大型异构体的目标确定后,再减去从所有RBP2目标揭示小异构体的目标。这些数据显示,其结合位点的基因组中的染色质相互作用的蛋白质招聘域的贡献。
RBP2异构体之间功能上的差异尚未确定。我们已经使用了一个全面的方式来确定约束RBP2亚型的基因组区域和定义,这些地区所代表的功能类别。这是通过获得序列的生物信息学分析读取芯片SEQ分析。
RBP2修改的组蛋白尾巴的甲基化赖氨酸残基。我们发现,RBP2大型异构体中含有甲基化的组蛋白赖氨酸和RBP2小,缺乏这种模块绑定到不同地区的人类基因组中(图5A)的亚型识别模块。更重要的是,异构体的特定区域和重叠的区域,属于基因具有不同的分子功能(图5B)。例如,“染色约束力”和“转录因子结合”功能,可以归因于RBP2小亚型的基因目标,但不是RBP2大型异构体(图5B)。通过比较实际的基因组产生的所有异构体和RBP2大型异构体(数据未显示),我们也可以定义,如果大量的异构体是专门招募某些基因。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是支持115347 – RSG – 08 – 271 – 01 – GMC从ACS,并通过CA138631授予由美国国立卫生研究院。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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37% formaldehyde solution | Fisher | F79500 | ||
BSA | USB | 10852 | ||
chloroform/isoamyl alcohol | Sigma | C0549 | ||
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | ||
EDTA | Fisher | BP120-500 | ||
EGTA | Sigma | E3889 | ||
Genomic DNA Sample Prep Kit | Illumina | FC-102-1001 | ||
glycerol | Sigma | G5516 | ||
glycogen | Boehringer | 901393 | ||
Hepes | Invitrogen | 15630080 | ||
KOH | Fisher | P250-500 | ||
LiCl | Sigma | L9650 | ||
Low molecular weight DNA ladder | NEB | N3233S | ||
sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | ||
N-lauroyl sarcosine | MP Biomedicals | 194008 | ||
NP-40 | Sigma | I3021 | ||
PBS | Fisher | mt21040cv | ||
phenol | Sigma | P-4557 | ||
Phusion DNA Polymerase | NEB | F-540S | ||
proteinase K | Gibco | 25530-049 | ||
QIAquick PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | ||
MinElute PCR purification Kit | QIAGEN | 28004 | ||
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | ||
RNAse A | Sigma | R4642 | ||
SDS | Invitrogen | 24730020 | ||
TE (endofree for maxi-prep kit) | QIAGEN | 19048 | ||
Tris | Sigma | 154563 | ||
Triton X-100 | Fisher | BP151100 | ||
Ultra Agarose, Certified low-range | BIO-RAD | 161-3106 |
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