本协议描述了如何形象蛋白质相互作用使用基于FRET的接近检测。
蛋白质 – 蛋白质相互作用,是所有重要的细胞过程的一个标志。然而,许多这些互动是短暂的,或大力弱,防止他们的身份,并通过分析传统的生物化学方法,如免疫共沉淀。在这方面,已经彻底改变了基因encodable的荧光蛋白(GFP,RFP等)及其相关荧光光谱重叠,我们有能力监测在体内的弱相互作用,使用福斯特共振能量转移 ( FRET)1-3。在这里,我们详细介绍我们使用一个基于FRET的接近检测,监测上的内皮细胞表面的受体受体相互作用。
有几个步骤是成功的关键。其中最突出的是两者之间的嵌合受体表达的相对水平。为了规避这个问题,可能使稳定的细胞系,表达利益蛋白,或确定载体DNA的最佳比例,允许相当于表达。同样,由于非均匀转跨菜,蛋白水平,很少会相当于细胞间。因此,一定要注意,“低”,以区别于“高”expressors。 ,显示“平均”的蛋白质含量通常会产生可靠和可重复性的FRET效率。我们的实验室一直奉行以减轻这个问题的方法之一是使用腺和lenti病毒“甚至是”基因的表达。此外,一个替代的方法来确定受体照片漂白FRET效率是致敏的排放。虽然,尽管敏排放实时监测单细胞的潜力,我们已经发现受体光漂白更敏感和更可靠。
最后,利用FRET技术来监测蛋白相互作用,可以是具有挑战性的的,需要谨慎选择的膜结合受体的链接长度。此外,除了C / YFP往往大大影响内质网和高尔基体蛋白表达水平的聚集和结果。然而,短暂的,不稳定的,互动的,FRET是理想的方法利用。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢共聚焦显微镜的帮助下,斯科特亨德森博士。这项研究是从美国国立卫生1RO1CA127501研究院的资助,以WAB的目标,以及来自梅西癌症中心和医学院(VCU),WAB的显微镜,在VCU – DEPT试点项目的资金支持。神经生物学及显微解剖设施,支持,从NIHNINDS中心核心授予5P30NS047463资金中的一部分,。