Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa Biyofilmler
Summary
Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Kültürlü insan hava yolu epitel hücreleri üzerinde biyofilm. Bu protokoller, biyofilm birim (CFU) oluşturan koloni ölçme, biyofilm boyama ve biyofilm sitotoksisite eğitimi, biyofilm görselleştirme dahil olmak üzere farklı yönlerini biyofilm oluşumu, çalışma adapte edilebilir.
Abstract
Bakteriyel biyofilm farklı insan hastalıklarının bir numara ile ilişkili olduğu, ancak biyofilm gelişimi genellikle cansız yüzeyler üzerinde çalışılmıştır. Bu çalışmada, kültür ortamında yetişen insan hava yolu epitel hücreleri (CFBE hücre) oluşturan Pseudomonas aeruginosa biyofilm için protokolleri açıklar. İlk yöntem (Statik Co-kültür Biyofilm Modeli olarak adlandırılan), P. aeruginosa, standart doku kültürü plakaları confluent mono tabakaları olarak yetişen CFBE hücreleri ile inkübe edilir . Bakterinin epitel hücreleri oldukça toksik olmasına rağmen, yeterince uzun arginin gecikmeler tek tabaka imha ek biyofilm için CFBE hücreleri oluşturmak için. İkinci yöntem (Akış Hücre Co-kültür Biyofilm Modeli olarak adlandırılır), biyofilm araştırma, CFBE hücrelerinin konfluent tek tabaka destekleyen bir cam lamel karşılamak için genellikle kullanılan bir biyofilm akış hücresi aparatı, adaptasyonu içerir. Bu tek tabaka P. inoküle aeruginosa ve peristaltik bir pompa sonra hücreler boyunca taze orta akar. Her iki sistemde de, bakteriyel biyofilm aşılama sonrası 6-8 saat içinde oluşur. Biyofilm Görselleştirme P. tarafından geliştirilmiş. aeruginosa suşları yapısal yeşil floresan proteininin (GFP) dile getirdi. Statik ve Akış Hücre Co-kültür Biyofilm deneyleri erken P. için model sistemler Kistik Fibrozis (KF) akciğer, ve bu tekniklerin P. aeruginosa enfeksiyonu farklı yönlerini izin aeruginosa biyofilm oluşumu ve virülans biyofilm sitotoksisite, biyofilm CFU ölçümü ve biyofilm boyama ve görselleştirme dahil olmak üzere, ele alınmalıdır.
Protocol
Discussion
Biyofilmler çevresel uyaranlara yanıt form bakteri toplulukları. Bu çevresel sinyaller, bir yüzey, toplama, exopolysaccharides üretim ve artan antibiyotik direnci 10 gibi diğer fenotipleri bağlanarak her bakteri içinde küresel düzenleyici değişimlere neden olmaktadır . Son birkaç on yıllar boyunca, pek çok kanıt biyofilmler kronik enfeksiyonların patogenezi büyük bir rol oynadığı hipotezini desteklemiştir. Örneğin, çok iyi kabul edilir P. aeruginosa, biyofilm 11…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz bu modellerin geliştirilmesinde rehberlik ve önerileriniz için G. Ç Toole teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Kistik Fibrozis Vakfı (ANDERS06F0 GGA, STANTO07RO ve STANTO08GA BAS), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GGA ve R01-HL074175 – BAS T32A107363) tarafından desteklenen ve Biyomedikal Araştırma Mükemmellik için, Ulusal Araştırma Kaynakları Merkezleri Merkezi (BAS Cobre P20-RR018787).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
References
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
