Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji

doi: 10.3791/2534 Published: June 15, 2011

Summary

Otizm ve şizofreni gibi ortak bir bozukluğa yol novo mutasyonlar bulmak için moleküler genetik strateji.

Abstract

De novo mutasyonlar otizm ve şizofreni gibi sık görülen bozukluklar için bir mekanizma olarak rol destekleyen kanıtlar birkaç satır vardır. İlk olarak, insanlarda de novo mutasyon oranı nispeten yüksek olduğu, nüfusun yüksek bir frekansta yeni mutasyonlar üretilir. Ancak, en yaygın hastalıklar içinde de novo mutasyon bildirilmiştir. Embriyonik aşamalarında ya da düşük üreme spor öldürücülüğü olarak fenotip karşı güçlü bir negatif seçim var ciddi hastalıklara yol açan genlerin mutasyonlar, birden çok aile üyelerine iletilen olmayabilir, ve bu nedenle bağlantı gen haritası ya da dernek tarafından tespit olmayacaktır çalışmaları. Tek yumurta ikizleri çok yüksek konkordans gözlem ve çift yumurta ikizleri çok düşük uyumu da güçlü vakaların önemli bir kısmı yeni mutasyonlar sonucu olduğu hipotezini destekler. İşte bu tür otizm ve şizofreni gibi hastalıklar için böyledir. İkincisi, azaltılmış üreme spor 1 ve son derece değişken çevresel faktörlere rağmen, bazı hastalıkların görülme sıklığı nispeten yüksek ve sabit bir hızda dünya çapında korunur. Bu, dünya çapında yaklaşık% 1 oranında bir insidans, otizm ve şizofreni için böyledir. Mutasyon yük için seçim arasında bir denge ya da de novo mutasyon zararlı bir mutasyon ve üretim karşı düşünülebilir. Alt üreme oranları, nüfusun sonuçta hastalığı prevalansının azalmasına yol açan mutant allel sayısını azaltmak gerekir olumsuz bir seçim faktörü oluşturmaktadır. Bu seçici baskılar, farklı ortamlarda farklı yoğunluk olma eğilimindedir. Bununla birlikte, bu ciddi ruhsal bozukluklar, bunların 2 karşı güçlü bir negatif seçim rağmen, dünya nüfusunun kültürlerden ve ülkelerden geniş bir aralığında sabit bir nispeten yüksek yaygınlık muhafaza edilmiştir. Bu yüksek yeni bir mutasyon oranı olmadığı sürece bir üreme spor azalmış hastalıklar ne olacağını tahmin değildir. Son olarak, baba yaşı etkiler:, yaşa bağlı artış baba de novo mutasyonlar sonucu artan baba yaşı ile hastalık riski anlamlı olarak artmıştır . Bu, otizm ve şizofreni 3 için böyledir . Mutasyon oranı erkek-kadın oranı muhtemelen germ hücre bölünmesi yaşla birlikte erkeklerde daha yüksek bir sayı nedeniyle, yaklaşık 4-6:1 tahmin edilmektedir. Bu nedenle, bir de novo mutasyonlar daha sık erkeklerde, özellikle yaşlı erkeklerde 4 geleceğini tahmin olacaktır. Genetik çalışmalar, şimdiye kadar birçok kompleksleri hastalıkları, otizm ve şizofreni gibi genler, yatkınlık genleri tanımlamak için başarısız oldu, neden ve hastalıkları insan genomunun sadece% 3 gen tespit edilmiştir neden yüksek oranda yeni mutasyonlar kısmen açıklayabilir . Bir hastalığın bir nedeni olarak de novo mutasyonlar için Kimlik okuyan veliler ve etkilenen konuları içeren hedeflenen moleküler yaklaşım gerektirir. Bir hastalığın genetik temeli de novo mutasyonlar ve moleküler yaklaşım, örnek olarak otizm ve şizofreni kullanarak, bu bağlantıyı gösterilecektir kurmak için neden olmadığını belirlemek için süreç .

Protocol

1. Novo mutasyonlar neden olabilir hastalığın Seçimi

Aşağıdaki kriterlere uyan bir hastalık de novo mutasyon hipotezi ile uyum:

  1. Üreme spor azalır.
  2. Ortamlarda yaygın olarak değişen rağmen hastalığın sıklığı nispeten yüksek ve sabittir.
  3. Hastalık yüksek bir baba yaşı ile ilişkilidir.
  4. Klasik bağlantı ve ilişki çalışmaları, hastalığın kalıtım önemli bir kısmını açıklamak için başarısız oldu.
  5. Ikiz uyumu verileri de novo modeli desteklemektedir.

Novo mutasyonlar kısmen genetik olarak açıklayabilir yaygın bir hastalıktır kritik bir ilk adım olduğunu olasılığını Analizi.

2. Olgu ve DNA örnekleri Seçimi

Uygun örneklerin seçimi de novo mutasyonlar kimlik başarısı için kritik öneme sahiptir. De novo mutasyon bulma şansı en üst düzeye çıkarmak için, aşağıdakileri öneririz:

  1. Etkilenmemiş anne-babalar, büyük babaları ve hastalığın hiçbir genişletilmiş aile öyküsü olan olgularda, erken yaşlarda başlangıçlı, şiddetli fenotipi seçin.
  2. Kullanılabilir DNA'lar çalışma yapmak için yeterli hastalarda seçin. Özellikle kritik kültür için tabi olmayan bir birincil hücre kaynağı (örneğin kan DNA veya tükürük DNA) DNA'nın kullanılabilirliği,
  3. (Vs de novo miras) mutasyon iletim durumunu belirlemek için her iki ebeveynin de DNA durumu kritik. Aday genler tespit kez ek etkilenen kohortlarında ve normal kontroller Durumu genetik doğrulama çalışmaları için gerekli.
  4. Mutasyonların oranı ekranlı olması için gen miktarı ve de novo mutasyon sonucu durumlarda fraksiyonu tahmin dayalı örneklem büyüklüğü tahmin ediyoruz.

3. Gene resequencing, iki ana yaklaşım

  1. Yüksek kalite, düşük verim sıralama
    Bu yaklaşım, aday genler yaklaşımları üzerine dayanır.
    1. Seçim aday gen (ler)
      6 ana kriter üzerine kurulmuş bir puanlama sistemine dayalı en iyi aday genler seçin. Sonra Tablo 1'de yer alan altı kriter kullanarak atfedilen tüm puan toplamına karşılık toplam hesaplar. Seçilmiş ve seçilen genlerin dağılımı Şekil 1 projemiz örneğe bakın.
      Tablo 1
      Aday gen seçimi için kullanılan Tablo 1. Kriterleri
      Şekil 1

      Şekil 1: Grafik projemiz sıralaması için seçilmiş ve seçilen genlerin dağılımını gösteren . Biz onların puan değerine göre sıralama genler tarafından aday özellikleri göre sıralanmış genlerin bir dağıtım elde etti. Örneğin, SHANK3 ve NRXN1 genler, iki gen de novo mutasyon bulundu, (maksimum 12) sırasıyla 7 ve 6 bir skor vardı.
    2. Exonprimer üzerinden Primers3 yazılım kullanarak Tasarım primerler. Sadece bölge kodlama ve ek kavşak ekson her tarafında fazladan bir 50 baz çifti de dahil olmak üzere kapalı olmalıdır.
    3. Taq seçimi için optimize PCR koşulları, reaksiyon hacmi, vb.
    4. Tüm PCR parçaları en iyi duruma getirme
    5. 5 ng genomik DNA standart prosedürlere göre kan örnekleri çıkarılan yükseltin
    6. PCR ürünleri% 2'lik agaroz jel yükleme sıralaması için göndermeden önce, kalite kontrol. Rastgele seçilen numuneler.
    7. Tek iplikli DNA Analyzer Sıra PCR ürünleri. Izleri üzerinden% 90 analiz mümkün olup olmadığını bir parçası başarılı bir şekilde sıralı olarak kabul edilir. Bu büyük ölçekli bir tarama için geçerlidir.
    8. Varyantlar Algılama
      1. PolyPhred, Polyscan ve Mutasyon Surveyor olarak genomik farklılıklar algılama ve genotipleme için araçlarını kullanın. En fazla 2 algılama araçları bir arada idealdir. Örneğin, v.5 PolyPhred ve varsayılan ayarları ile aynı varyasyonlara algılamaz v.6 PolyPhred. V.3 Polyscan SNP (% 96) ve daha az INDELs (% 93) yüksek yalancı pozitif mutasyon oranı vardır. PolyPhred v.6 gerçek INDELs çoğunluğu algılandı ancak daha düşük (% 90) Polyscan v.3 genel bir yanlış pozitif mutasyon oranı (INDELs için) yoktu. Biz algılama SNP v.3 Polyscan seçeneği kaldırmak ve v.5 PolyPhred hem tutmak ve değişken tespiti için v.6 PolyPhred. Mutasyon Surveyor ve Polyscan indels saptamak için daha iyi. Not: Polyscan kullanarak SNP algılama seçeneği uygulanmamalıdır. Sadece "indel" seçeneği olmalıdır. Polyscan SNP tespiti için birçok yalancı pozitif sonuç elde etti.
      2. Her benzersiz bir roman exonic türevlerini tespit için, parça ve resequ reamplifying elle onaylamak, herhangi bir teknik yapıyı ortadan kaldırmak için ileri ve ters primerler kullanarak Proband ve her iki ebeveyn encing.
  2. Tüm exome sıralama
    Bu yaklaşım insan genomları bölgeleri kodlama çoğunluğu yüksek işlem hacmi hedefleyen bir sıralama. Şimdi şu anda potansiyel aday genlerin tespiti hızlandırarak, laboratuarımızda bu yeni yaklaşım kullanıyorsanız.
    1. Roche gibi başkaları tarafından Agilent veya diğer herhangi bir benzer ürün tarafından tasarlanan 16.000 'den fazla gen kodlama bölgesi (50 MB genom) hedef alan "SureSelect İnsan Tüm Exon" sipariş edin. Yakalama seti sipariş etmek için önce, sıralama platformlar (Illumina vs katı) belirlemek olmalıdır.
    2. Agilent protokolüne göre yakalama yapın
    3. Sıra ilgili kullanılabilir yeni nesil bir platform ürün
    4. Tüm exome sıralama Variant algılama: BWA, bfast, hizalama gerçekleştirecek Bioscope nesil sıralama platformu genomik farklılıklar tespit edilmesi ve genotipleme için çeşitli biyoinformatik araçlar mevcuttur. Sonra ek olarak serbestçe kullanılabilir downstream araçları (örneğin SAM araçları, Varscan, Annovar) varyantları arama ve açıklama için gerekli olacaktır. Dizi hizalama ve varyant arama ve işaretleme içermektedir Ticari yazılım NextGen (Softgenetics), CLC Bio ve diğerleri olarak da mevcuttur

4. Genomik varyantları önceliklendirme

Belirlenen türevleri de novo protein ya da mRNA fonksiyonu ve / veya yapı için zararlı olmaktan olasılık göre takip öncelik verilir. Varyant aşağıdaki gibi olmalıdır de novo varyant tespiti için öncelikler takip:

  1. Benzersiz varyasyonlarını (tek bir durumda bir zamanlar gözlemlediği)
  2. Çeşitlemeler, veliler mevcut değil
  3. Protein kesiliyor varyasyonları: saçmalık, Frameshift ve ekleme mutasyonlar önde gelen indels.
  4. Missense ve sessiz değişimi (örneğin, mRNA örgüsünü etkiler) işlevsel yıkıcı öngördü. Proteinin fonksiyonel tahmin etkisi için Polyphen, SIFT ve PANTHER kullanın.

Tüm exome sıralama kullanarak, aday genler seçimi, daha fazla çalışma için öncelik türevleri için bir strateji olarak kullanılabilir.

5. Genetik doğrulama

  1. Ek durumlarda hasta (diğer etken mutasyonları tespit etmek) ve kontrol grubunda tüm gen Resequence. Kontrol örnekleri öncelikli varyantları alel frekansları değerlendirmek için kullanılabilir. Farklı hastalarda (ancak kontrol örnekleri veya kamu veritabanları) bulunan en az iki farklı de novo zararlı mutasyonlar (saçmalık, yapıştırma, frameshifts ve zarar missense tahmin) içeren herhangi bir genin ileri doğrulama çalışmaları için yüksek öncelik verilmelidir. 1) hasta türetilen lenfoblastoid hücre hatları potansiyel bir ekleme kusur testi: Bu içerir. Deneyimlerimize göre, genlerin çoğu lenfoblastoid hücre hatları RT-PCR ürünlerinin verim, 2) daha fazla test fonksiyonel düzeyde gen mutasyonu /) lenfoblastoid hücre hatları ve 3 protein özleri kantitatif Western Blot analizi ile değişmiş protein ekspresyon düzeyleri araştırılması hayvan (c elegans, Zebra balığı) ve daha önce bizim grup (örn: 5,6) tarafından yapılan gibi hücre hattı modelleri.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu protokol, şizofreni ve otizm için yeni genleri tanımlamak mümkün. Bir örnek, son zamanlarda SHANK3 gen bulunması (Şekil 2). SHANK3 genin iki farklı de-novo mutasyonlar, tek etkilenen kadın üç etkilenen erkek kardeşi ve bir missense mutasyon bulunan bir saçmalık mutasyon.

Şekil 2
Şekil 2. (A) etkilenen üç kardeş aile PED 419 R1117X anlamsız mutasyon ayrılığı. Proband ok ile gösterilir. PED 56 (B) Proband R536W missense mutasyon ayrımı değil, onu etkilenmeyen kardeşi.

Discussion

Burada özetlenen prosedür muhtemel sonucu, kısmen de novo mutasyonlar ve bu hipotezi kanıtlamak için belirli ortak hastalıkları tanımlamak için hedefliyor. De novo mutasyonlar, örneğin kalıtsal kanser sendromları hastalıklar, bir dizi geliştirme için iyi kurulmuş bir mekanizmadır, fakat kötü yaygın hastalıklar araştırılmalıdır olmuştur. Bu, büyük miktarda DNA, sadece sahip diziliminin gerektirir de novo mutasyonlar, tanımlanması teknik zorluklardan kısmen sonuçları çok kısa bir süre önce Yeni Nesil Sıralama gelişine uygun maliyetli hale. Buna ek olarak, insanlarda de novo mutasyon oranı, çok yakın zamanlara kadar, sadece bir tahmin. Çok kısa bir süre orada raporları doğrudan insanlarda mutasyon oranı tespit edilmiştir. Bu ölçümler öncesinde, bu tür bir çalışma için gerekli örnek boyutunu tahmin etmek ve gözlenen de novo mutasyon oranı temel oranından daha büyük olup olmadığını belirlemek için zor oldu . Tüm genom karşı aday genler Sıralama? Rapor edilen hastalık mutasyonların çoğunluğu missense / saçmalık mutasyonlar ve bizim tarama stratejisi bilinen mutasyonların% 68 üzerinde tespit splice site mutasyonları (HGMD web sitesine göre). Amino asit değişimi şiddeti ve klinik fenotip olasılığı arasında açık bir ilişki de yoktur. Gibi muhafazakar bir amino asit ikamesi ile karşılaştırıldığında, saçma bir değişikliği 9.0 kez klinik 7 sunmak için muhtemeldir. Bu nedenle, şu anda sıralama aday genler en maliyet etkin bir stratejidir.

Özetlenen prosedür başarı ayrıntılı olarak özetlenen ve iki örnek, otizm ve şizofreni ile gösterilmiştir bazı kritik adımları bağlıdır. Seçmek için hangi hastalık gibi kaçınılması gereken birçok tuzaklar, hangi hastaların ekran, DNA kaynağı ve de novo mutasyon verimli bir şekilde tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Biz en verimli şekilde, herhangi bir hastalık gibi spontan mutasyonlar sonucu vakalarının kısmını belirlenmesi için bir yöntem sağlar.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Kanada Yenilik Vakfı (S2D) projesi 'Hastalık Synapse' fon için fon kaynakları Genom Kanada ve genom Québec ve Université de Montréal yanı sıra fon sayesinde.

References

  1. Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. Reproductive fitness in familial schizophrenia. Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).
  2. Jablensky, A. Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study. Psychol Med Monogr. Suppl 20. 1-97 (1992).
  3. Malaspina, D. Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes. CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).
  4. DeLisi, L. E. A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder. Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).
  5. Gauthier, J. De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. Forthcoming (2010).
  6. Piton, A. Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism. Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).
  7. Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes. Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).
Ortak Bozuklukları de Novo Mutasyonlar, otizm ve şizofreni gibi tanımlayın Bir Strateji
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Julie, G., Hamdan, F. F., Rouleau, G. A. A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia. J. Vis. Exp. (52), e2534, doi:10.3791/2534 (2011).More

Julie, G., Hamdan, F. F., Rouleau, G. A. A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia. J. Vis. Exp. (52), e2534, doi:10.3791/2534 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter