Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Assessing Gravende, Nest Construction, og hamstring i Mus

doi: 10.3791/2607 Published: January 5, 2012

Summary

Gravende, hekke-og hamstring er arter, typiske aktiviteter som mus lett utføre i laboratoriet. Denne artikkelen beskriver hvordan de kan være enkelt og billig vurdert. Disse protokollene er ekstremt følsomme for mus belastning, hjerneskader og sykdommer. Videre utgjør de "miljømessige berikelse" for musene, og legemliggjøre "Refinement" aspekt av "3 Rs" 18.

Abstract

Forringelse i evnen til å utføre "dagliglivets aktiviteter" (ADL) er et tidlig tegn på Alzheimers sykdom (AD). Prekliniske atferdsmessige screening av mulige behandlinger for AD tiden i stor grad fokuserer på kognitive tester, som ofte krever dyrt utstyr og massevis av eksperimentator tid. Imidlertid er human episodisk minne (de mest alvorlig rammede aspekt av minne i AD) annerledes gnager minne, som synes å være stort sett ikke-episodisk. Derfor er dagens måter screening for nye AD behandlinger for AD i gnagere er egentlig lite sannsynlig å lykkes. En ny tilnærming til prekliniske screening ville være å karakterisere ADL av mus. Tilfeldig, har flere slike analyser nylig blitt utviklet ved Oxford, og her de tre mest sensitive og godt karakterisert presenteres.

Gravende ble først utviklet i Oxford 13. Det utviklet seg fra et behov for å utvikle en mus hamstring paradigme. Mest publisereed gnager hamstre paradigmer som kreves et fjernt matkilde å være knyttet til hjemmet buret med en tilkobling passasje. Dette vil innebære endring av hjemmet buret samt lage en mus-proof koble passasjen og matkilde. Så var det vurderes om det ville være mulig å sette maten kilden inne i buret. Det ble funnet at hvis en container ble plassert på gulvet ble det tømt innen neste morgen. Var Maten pellets imidlertid bare deponeres i en haug ved container inngangen, i stedet plassert i en diskret sted vekk fra beholderen, som kan forventes dersom musene var virkelig hamstring dem. Lukk inspeksjon viste at musene utførte grave ("gravende") bevegelser, ikke bærer pellets i munnen til et utvalgt sted som de ville hvis virkelig hamstre dem. 6

Mat pellets er ikke en viktig substrat for gravende, mus vil tomme rør fylt med sand, grus, selv skittent sengetøy fra sitt eget bur. Merover, vil de tømme en full tube selv om en tom en er plassert ved siden av den 8.

Flere hekkende protokoller finnes i litteraturen. Den nåværende Oxford en forenkler prosedyren og har en veldefinert scoring system for reir kvalitet 5.

En hamstre paradigme ble senere utviklet der mus, snarere enn hamstre tilbake til den virkelige hjem bur, var tilpasset å leve i "hjemmebase" av en hamstring apparat. Denne basen var koblet til et rør laget av netting, den distale enden av som inneholdt matkilde. Denne ordningen viste seg å gi gode hamstre oppførsel, så lenge musene var tilpasset å leve i "base" i løpet av dagen og bare lov å gå inn i hamstre rør om natten.

Protocol

1. Gravende

1. Apparatus

Forskjellige container design ble prøvd (for eksempel et metall mugge som kan være enkelt å rengjøre, men mus var motvillige til å oppgi det). Etter hvert ble det oppdaget at en lengde av plast nedløpsrøret (som kobles til takrenner på hus) forhøyet litt i den ene enden for å hindre utilsiktet (ikke-bevisst) forskyvning av mat pellets og forseglet i den andre enden, var en effektiv stykke apparater. Burrows er nå laget av plast nedløpsrøret, 68 mm diameter, kuttet i 20 cm lange lengder (figur 1). Den ene enden er forseglet med en plugg på 12 mm medium density fiberplate (MDF). (Åndedrettsvern anbefales når du arbeider med MDF). For rengjøring og impregnering, kan en vanntett lim mastik sammensatte brukes på innsiden og utsiden av MDF samt servering å lime den inn i gravende tube. Machine skruer (5 cm lang) brukes til å heve den andre enden of røret 3 cm opp fra gulvet. To hull er boret 1 cm fra den åpne enden av gravende røret i en vinkel på 90 ° og skruene satt inn og strammet fire.

Diameteren på hulene er trolig avgjørende; Schmid-Holmes et al 19 observert at mus i naturen "hule renset" hovedsakelig fra Burrows lik i størrelse til våre kunstige seg..

Figur 1

Figur 1. En mus i et gravende tube.

2. Prosedyre

  1. Tilvenning
    Gravende er normalt spontan, men det er en viss læring element. Læringsprosessen er forbedret med sosial tilrettelegging. Derfor plasserer en full hule natten inn i gruppen hjemmet bur av mus som senere skal testes med en behandling. Hver hule er fylt med 200 g av maten pellets normalt leveres som diett. (Dette refererer til than tett komprimert type diett, hvis en "utvidet" diett er i bruk den hule vil holde mindre enn 200g). Forskere bør ta hensyn til slike faktorer ved valg av et gravende substrat.

    Dersom musene er på mat rasjonering (for eksempel for å motivere dem til å kjøre en samtidig labyrint læring oppgave) non-food stoffene kan brukes, for eksempel leire baller, som brukes til linje overflaten av jord i innendørs blomsterpotter; ert takspon (små steiner ~ 1 cm diameter) og sand. Pea singel og sand, som er tre ganger tyngre enn mat pellets, er nyttige substitutter for mat pellets dersom musene er gravende veldig kraftig, for å unngå en "tak-effekt".
  2. Baselining
    Run (helst to) baseline gravende tester 48 h fra hverandre på samme måte som vil bli gjort for testing etter den foreslåtte behandlingen. Testen er optimalt startet rundt 16:00 hvis musene er plassert på en 0700-1900 h mørk-lys syklus. Dette er en følsom tidtil test, som de normalt ikke våken på denne tiden og gravende starter saktere enn om de var godt i den mørke fasen og dermed svært aktiv. To timer etter start, er et "øyeblikksbilde" måling tatt av vekten av maten gravde, den hule blir tømt i en tared container og veies og pellets erstattet inn i hule som er satt tilbake i buret. Dersom musen er i hule, bare forsiktig helle det og innholdet inn i veiing beholderen og erstatte musen i buret. Vekten gravde på to timer beregner deretter subtraksjon fra den opprinnelige 200 g. Den endelige lesing er tatt neste morgen. Timing er ikke kritisk som musene vil ha gått tilbake til å sove (ofte i hule) og er ikke lenger aktivt gravende. Bruk 2 t måling tatt på andre prøve å danne grupper balansert for baseline ytelse. Som gravende øker med praksis 17, hjelper baselining også musene å komme mer stabil asymptotic ytelse som avslører behandlingseffekter bedre.
  3. Testing
    For testing, er etter behandlinger administreres musene får gravende test nøyaktig det samme som i baselining scenen. Hvis gravende test skal brukes kronisk, anbefales det at minst 48 h separate testene for å unngå en nedgang i ytelse på grunn av over-eksponering til prosedyren.
  4. Merk
    Erstatter ikke gravde mat på buret gulvet inn i hule. Selv om musen har ikke gravde noe, utføre veie prosedyre som du ville gjort hvis gravende hadde forekommet; forstyrrelse forårsaket av veier tendens til å stimulere atferd, og mus som allerede har gravde en del av underlaget vil ofte begynne gravende med fornyet kraft etter veiing prosess.

2. Forventede resultater

C57 ~ BL / 6 mus typisk hule rundt 70 gram i de to første timene, og nær 200 gover natten. Hippocampus lesioned mus ofte hule mindre enn 5 g 11 (figur 2). Prion sykdom hemmer gravende 1,2, gjør som lipopolysakkarid administrasjon 20. Gravende kan oppdage prion (scrapie) sykdom på 10-12 uker etter injeksjon av syke hjerne homogenate, mens kliniske tegn kun vises på 22 uker 13. (Figur 3). Gravende har vist seg å være følsomme for belastning forskjeller 15 og knock-out av kalium ionekanal underenhetene 10.

Figur 2

Figur 2. Vekt av mat pellets (medianer og interkvartilt områder) gravde i to timer av kontroll og hippocampus-lesioned mus. Sistnevnte gravde betydelig mindre enn kontroller (P = 0,0001).

Figur 3

Figur 3. Vekt avmat pellets (betyr) gravde over natten ved kontroll og skrapesyke-infiserte mus. Gravende øker (med praksis) i begge gruppene fra uke 7-10 etter injeksjon, men fra uke 12 gravende fall i skrapesyke gruppen og forskjellen mellom gruppene blir statistisk signifikant (overstiger to standardfeil for gjennomsnittet).

3. Diskusjon

Vi har testet gravende i andre arter av gnagere - rotter, ørkenrotte, hamstere og egyptiske spiny mus 8. Alle men sistnevnte kan bli overtalt til å grave betydelige mengder terrestrisk underlag som grus eller sand, men gravende av mat pellets var mye mindre, selv etter lang erfaring med terrestriske materiale. Grunnen til denne forskjellen fra mus er ikke kjent. Etter at dette arbeidet var gjort, ble det oppdaget at egyptiske spiny mus ikke faktisk gjør hulene i naturen, de kan okkupere Burrows laget av ørkenrotte, også overflaten av deres naturlige habitat er ofte hard rock. Siste observasjon i Nairobi viste at innenfor slekten Acomys, Wilsons spiny mus (Acomys wilsoni) og Percival er spiny mus (Acomys percivali), som gjør hule i de ville, også gravde i laboratoriet.

Fire. Hekkende

1. Apparatus

Denne testen er utført i den enkelte bur, de samme som brukes for gravende er egnet. Normal sengetøy bør dekke gulvet til en dybde på 0,5 cm. (Variasjon i dybde, og veldig dype senger, kunne påvirke hekker konstruksjon). Hvert bur er utstyrt med en "Nestlet", en 5 cm i firkant av presset bomull batting (Ancare).

2. Prosedyre

Mus er plassert enkeltvis i hekkende burene ca en time før de mørke fase, og resultatene er vurdert neste morgen. Som med gravende og lignende årsaker, er timingen ikke kritisk.

3.Scoring

Den hekker vurderes på en 5-punkts skala (figur 4-8), og mengden av untorn Nestlet er også veide 5.

  1. Den Nestlet er stort sett uberørt (> 90% intakt).
  2. Den Nestlet er delvis revet opp (50-90% gjenværende intakte).
  3. Den Nestlet er mest shredded men ofte er det ingen identifiserbar nest site: <50% av Nestlet forblir intakt, men <90% er innenfor en fjerdedel av buret gulvareal, dvs. bomull ikke er samlet i et reir, men spredt rundt i buret . Merk: materialet kan noen ganger være i en bredt definert reir området, men den kritiske definisjon er at 50-90% har blitt makulert.
  4. En identifiserbar, men flat hekker:> 90% av Nestlet er revet opp, er materialet samlet i et reir i en fjerdedel av buret gulvareal, men reiret er flatt, med vegger høyere enn mus kroppsstørrelse (krøllet opp på sin side) på mindre enn 50% av omkretsen sin.
  5. A (nær) perfekt nest:> 90% av Nestlet er revet opp, er reiret et krater, med vegger høyere enn mus kroppshøyde på mer enn 50% av omkretsen sin.

Der kriteriene ikke enige splittet forskjellen. For eksempel en perfekt reir med en unshredded 0.7g stykke ville poengsum 4.5.

Figur 4

Figur 4. Nest score 1

Figur 5

Figur 5. Nest vurdering 2

Figur 6

Figur 6. Nest vurdering 3

Figur 7

Figur 7.. Nest vurdering 4

Figur 8

Figur 8. Nest score 5

Fire. Forventede resultater

Både hanner og hunner lage reir, som deres formål er termoregulering samt å være forbundet med reproduksjon. For C57BL / 6 mus, reir score for menn og kvinner er i samme størrelsesorden, selv om vi ikke har gjort en kontrollert sammenligning i et enkelt eksperiment. De fleste C57BL / 6 mus poengsum 4-5 på reir konstruksjon, men når hippocampus er lesioned medianen poengsum ville bli rundt 1-2, en score på 3 vil neppe bli overskredet (figur 9). Nesting også vist seg å være følsomme for prion sykdom rundt 10-12 uker 1,2,16.

Figur 9

Figur 9. Nest score (medianer og interkvartilt områder) for kontroll mus og mus med lesjoner av dorsal, ventral og komplett hippocampus. Bare fullstendige lesioned mus viser hemming av hekkende, så effekten av selektiv dorsal og ventral regionene vises sub-terskel, men additiv.

5. Hamstring

1. Apparatus

En serie av "home baser" er koblet til rør laget av netting, forseglet permanent på den distale enden hvor maten pellets er plassert midlertidig på den proksimale enden av en tre plugg. Dette brukes for å hindre musene inn i rørene før tilpasning til hjemmebasen har occurred7.

Apparatet (Figur 10) kan gjøres på forskjellige måter, så lenge de grunnleggende prinsippene blir fulgt. Ours består av en rad av åtte trekasser, hver 30 x 13 x 15 cm med gjennomsiktig pleksiglass lokk. Hver er utstyrt med en vannflaske, og har et hull i ryggen inn som hamstre røret er push-montert. Rørene er laget av sort plast, 10 cm lang, 40 mm diameter, ble til en netting tube, 45 cm lang, 4 cm diameter, for å danne en total lengde på 50 cm. Den mesh består av 13 mm kvadrater,og er en dobbel roll med maskene mis-justert for å lage hullene i mesh mindre og unngå mat pellets slippe gjennom. Hvis 6 mm firkantet mesh er tilgjengelig dette er et bedre materiale som en roll ville være tilstrekkelig. Den distale enden av røret, der maten pellets er plassert, er stengt. Den proksimale enden er forseglet med en avtagbar tre plugg.

Figur 10

Figur 10. Mus i hamstring rør

2. Prosedyre

  1. Vanligvis er hamstre svært variabel første gang og noen mus kan ikke hamstre i det hele tatt. Hamstre, som gravende, øker med praksis. Derfor, der eksperimentell design tillater, er baselining økter beste gitt før en behandling gis. Åpenbart er dette ikke praktisk hvis den uavhengige variabelen er medfødt, som med en (ikke-betinget) mutant mus eller når teste ulike musestammer.
  2. En mus er satt ihver boks tidlig på dagen å tilvenne seg til det. Boksen er utstyrt med en papp tunnel som har vært i The Real Group hjem bur for minst én natt, også en sjenerøs porsjon av skitne senger, slik at det føles som "hjem". Tilgang til hamstre røret er forhindret til kveld med en tre bung. 100 g mat pellets (en blanding av små og store) er plassert på den distale enden av hamstre tube (ved å helle dem i den andre enden med tube holdt vertikalt). Å sørge for at musen er mildt sagt sulten før testing begynner, er hjemmet boksen ikke utstyrt med mat.
  3. Like før starten av den mørke fasen, fjerne tre bung å tillate musen tilgang til hamstring tube. Den neste morgen (igjen, er timingen ikke kritisk) samler og veie all maten pellets som har blitt hoarded inn i hjemmet basen boksen.

Seks. Forventede resultater

Ved hjelp av kvinnelige C57BL / 6 mus, ville median beløpet hoarded være rundt50-70 g. Hippocampus lesjoner sterkt undertrykke hoarding11, mens prefrontal cortex lesjoner har bare en svak effekt 12 (Figur 11).

Figur 11

Figur 11.. Vekt på mat pellets hoarded av kontroll og medial prefrontal cortex-lesioned mus (medianer og interkvartilt områder). Selv om medianer varierer betydelig, betyr høy variabilitet i kontrollene resultatet er langt fra statistisk signifikant (P = 0,3).

Discussion

Disse testene er svært enkel å kjøre, men effekten størrelsene er svært store, noe som gjør dem ekstremt følsomme for behandlinger, stamme forskjeller, osv. De er i samsvar med "Refinement" aspekt av Russell og Burch er 3 Rs "18. Faktisk synes gode prestasjoner på tester som gravende å være en indikasjon på god generell helse hos dyr. Derfor kan dette være en god test for vurdering av dyrevelferd.

Betydningen av miljømessige berikelse for laboratorium gnagere er godt anerkjent i disse dager. Utdeling av hekkende materialet er nå vanlig praksis i mange dyre hus, og dette er enkelt å gjøre. Den entusiasme som mus hule gjør gravende en potensielt god berikelse, men dessverre en "self-omlasting" hule som ville være en praktisk måte å sørge for dette er ennå ikke utviklet. Enten mus finner hamstre berikende ennå ikke er bestemt.

_content "> En ulempe er at dataene som genereres av disse testene er generelt ikke-parametrisk (ikke Gauss i distribusjon), er så passende ikke-parametrisk statistikk for å analysere dem, f.eks Mann-Whitney U test for parvise sammenligninger, Kruskal- Wallis ANOVA for multi-gruppen data. Dersom gjentatte tiltak design er brukt, siden det er ingen egnet ANOVA test for ikke-parametriske data, kan resultatene bli forvandlet, for eksempel ved kvadratroten eller logge prosedyrer for å gjøre dem samsvare med en mer normal fordeling .

Målingene av apparatet kan være litt annerledes enn de som er spesifisert i teksten (nyttig for USA forskere), men store forskjeller bør unngås. Men i noen tilfeller andre forskere kan finne ulike konstruksjoner fungerer bedre enn de som beskrives her.

Som for alle atferdsmessige målinger, bør musene testes for å se om deres aktivitetsnivå er normale, vil som inaktivitet har åpenbart detrimental effekt på arter-typisk atferd. Når skrapesyke-infiserte mus ble som viser svekket gravende og nesting, var deres aktivitetsnivå normale (testet i et åpent felt apparat). Faktisk oppstår en periode med hyperaktivitet rundt 2-4 uker etter disse artene, typiske atferd er først svekket to.

Den sterke verdifall produsert av hippocampus lesjoner på gravende, hekke-og hamstring, som alle er arter-typisk atferd, utfyller de svekkelser i romlig læring og memory9 som er så veletablert effektene av disse lesjonene. De synes å være likeverdig med svekkelser i daglige gjøremål så karakteristisk for AD 14.

Disse artene-typiske tester kan godt vise seg å være til stor nytte i prekliniske screening for behandlinger for Alzheimers og andre nevrodegenerative sykdommer 14. I mange menneskelige hjerne lidelser et tap eller redusert evne til å utføre normal everyday oppgaver er like viktig som andre funksjoner av sykdommen som kognitiv svekkelse. Spesielt kan dette tapet nødvendiggjøre involvering av pleiere og de store sosioøkonomiske byrden dette så ofte medfører.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

The Wellcome Trust for å gi Open Access finansiering til Oxford University. Robert Deacon er medlem av Oxford OXION gruppe, finansiert av Wellcome Trust stipend WT084655MA.

References

  1. Cunningham, C., Deacon, R. M. J., Chan, K., Boche, D., Rawlins, J. N. P., Perry, V. H. Neuropathologically distinct prion strains give rise to similar temporal profiles ofbehavioural deficits. Neurobiol. Dis. 18, 258-269 (2005).
  2. Cunningham, C., Deacon, R., Wells, H., Boche, D., Waters, S., Picanco Diniz, C., Scott, H., Rawlins, J. N. P., Perry, V. H. Synaptic changes characterize early behavioural signs in the ME7 model of murine prion disease. Eur. J. Neurosci. 17, 2147-2215 (2003).
  3. Damiani, R., Modesto, S., Yates, A., Neveling, J. Earliest evidence of cynodont burrowing. Proc. R. Soc. Lond. B. 270, 1747-1751 (2003).
  4. Deacon, R. M. J. Burrowing in rodents: a sensitive method for detecting behavioral dysfunction. Nat. Protocols. 1, 118-121 (2006).
  5. Deacon, R. M. J. Assessing nest building in mice. Nat. Protocols. 1, 1117-1119 (2006).
  6. Deacon, R. M. J. Digging in Mice: Marble Burying, Burrowing, and Direct Observation Reveal Changes in Mouse Behavior. Mood and anxiety related phenotypes in mice. Gould, T. D. Humana Press. New York. (2009).
  7. Deacon, R. M. J. Assessing hoarding in mice. Nat. Protocols. 1, 2828-2830 (2006).
  8. Deacon, R. M. J. Burrowing: A sensitive behavioural assay, tested in five species of laboratory rodents. Behav. Brain. Res. 200, 128-133 (2009).
  9. Deacon, R. M. J., Bannerman, D. M., Kirby, B. P., Croucher, A., Rawlins, J. N. P. Effects of cytotoxic hippocampal lesions in mice on a cognitive test battery. Behav. Brain. Res. 133, 57-68 (2002).
  10. Deacon, R. M. J., Brook, R. C., Meyer, D., Haeckel, O., Ashcroft, F. M., Miki, T., Seino, S., Liss, B. Behavioral phenotyping of mice lacking the KATP channel subunit Kir6.2. Physiol. Behav. 87, 723-733 (2006).
  11. Deacon, R. M. J., Croucher, A., Rawlins, J. N. P. Hippocampal cytotoxic lesion effects on species-typical behaviors in mice. Behav. Brain. Res. 132, 203-213 (2002).
  12. Deacon, R. M. J., Penny, C., Rawlins, J. N. P. Effects of medial prefrontal cortex cytotoxic lesions in mice. Behav. Brain. Res. 139, 139-155 (2003).
  13. Deacon, R. M. J., Raley, J. M., Perry, V. H., Rawlins, J. N. P. Burrowing into prion disease. Neuroreport. 12, 2053-2057 (2001).
  14. Deacon, R. M. J., Rawlins, J. N. P. Hippocampal lesions, species-typical behaviours and anxiety in mice. Behav. Brain. Res. 156, 241-249 (2005).
  15. Deacon, R. M. J., Thomas, C. L., Rawlins, J. N. P., Morley, B. J. A comparison of the behavior of C57BL/6 and C57BL/10. Behav. Brain. Res. 179, 239-247 (2007).
  16. Guenther, K., Deacon, R. M. J., Perry, V. H., Rawlins, J. N. P. Early behavioural changes in scrapie-affected mice and the influence of dapsone. Eur. J. Neurosci. 14, 401-409 (2001).
  17. Mallucci, G. R., White, F. armer, Dickinson, M., Khatun, A., Powell, H., Brandner, A. D., Jefferys, S., R, J. G., Collinge, J. Targeting Cellular Prion Protein Reverses Early Cognitive Deficits and Neurophysiological Dysfunction in Prion-Infected Mice. Neuron. 53, 325-335 (2007).
  18. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Methuen, London. (1959).
  19. Schmid-Holmes, S., Drickamer, L. C., Robinson, A. S., Gillie, L. L. Burrows and burrow cleaning behaviour of house mice. Am. Mid. Nat. 146, 53-62 (2001).
  20. Teeling, J. L., Felton, L. M., Deacon, R. M. J., Cunningham, C., Rawlins, J. N. P., Perry, V. H. Sub-pyrogenic systemic inflammation impacts on brain and behavior, independent of cytokines. Brain Behav. Immun. 21, 836-850 (2007).
Assessing Gravende, Nest Construction, og hamstring i Mus
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Deacon, R. Assessing Burrowing, Nest Construction, and Hoarding in Mice. J. Vis. Exp. (59), e2607, doi:10.3791/2607 (2012).More

Deacon, R. Assessing Burrowing, Nest Construction, and Hoarding in Mice. J. Vis. Exp. (59), e2607, doi:10.3791/2607 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter