Micropatterned Hydrogels के तंत्रिका संस्कृति गतिशील मास्क प्रोजेक्शन Photolithography का उपयोग कर सिस्टम के लिए निर्माण कार्य

Summary

Microfabricated तंत्रिका संस्कृति नियमित रूप से सेल संस्कृति substrates पर गतिशील मुखौटा प्रक्षेपण लिथोग्राफी के लिए एक डिजिटल micromirror उपकरण का उपयोग कर प्रणाली का तेजी से उत्पादन के लिए सरल तकनीक वर्णित हैं. ये संस्कृति प्रणालियों प्राकृतिक जैविक वास्तुकला का अधिक प्रतिनिधि हो सकता है और तकनीक वर्णित कई अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the need for 3D environments to represent in vitro experiments which better mimic in vivo qualities ^1-3. Studies in fields such as cancer research ⁴, neural engineering ⁵, cardiac physiology ⁶, and cell-matrix interaction^7,8have shown cell behavior differs substantially between traditional monolayer cultures and 3D constructs.

Hydrogels are used as 3D environments because of their variety, versatility and ability to tailor molecular composition through functionalization ^9-12. Numerous techniques exist for creation of constructs as cell-supportive matrices, including electrospinning¹³, elastomer stamps¹⁴, inkjet printing¹⁵, additive photopatterning¹⁶, static photomask projection-lithography¹⁷, and dynamic mask microstereolithography¹⁸. Unfortunately, these methods involve multiple production steps and/or equipment not readily adaptable to conventional cell and tissue culture methods. The technique employed in this protocol adapts the latter two methods, using a digital micromirror device (DMD) to create dynamic photomasks for crosslinking geometrically specific poly-(ethylene glycol) (PEG) hydrogels, induced through UV initiated free radical polymerization. The resulting “2.5D” structures provide a constrained 3D environment for neural growth. We employ a dual-hydrogel approach, where PEG serves as a cell-restrictive region supplying structure to an otherwise shapeless but cell-permissive self-assembling gel made from either Puramatrix or agarose. The process is a quick simple one step fabrication which is highly reproducible and easily adapted for use with conventional cell culture methods and substrates.

Whole tissue explants, such as embryonic dorsal root ganglia (DRG), can be incorporated into the dual hydrogel constructs for experimental assays such as neurite outgrowth. Additionally, dissociated cells can be encapsulated in the photocrosslinkable or self polymerizing hydrogel, or selectively adhered to the permeable support membrane using cell-restrictive photopatterning. Using the DMD, we created hydrogel constructs up to ~1mm thick, but thin film (<200 μm) PEG structures were limited by oxygen quenching of the free radical polymerization reaction. We subsequently developed a technique utilizing a layer of oil above the polymerization liquid which allowed thin PEG structure polymerization.

In this protocol, we describe the expeditious creation of 3D hydrogel systems for production of microfabricated neural cell and tissue cultures. The dual hydrogel constructs demonstrated herein represent versatile in vitro models that may prove useful for studies in neuroscience involving cell survival, migration, and/or neurite growth and guidance. Moreover, as the protocol can work for many types of hydrogels and cells, the potential applications are both varied and vast.

Protocol

1. DMD सेटअप डीएमडी बोर्ड, यूवी प्रकाश गाइड (collimator के साथ) और 4x उद्देश्य लेंस सब एक कंपन अलगाव की मेज पर खड़ी घुड़सवार हैं. यूवी प्रकाश गाइड समायोजित किया जाना चाहिए कि प्रकाश दर्पण, दर्पण के विमान से नीचे और 24 ° (चित्रा 1) के विमान के सापेक्ष 45 ° का एक कोण पर दर्पण सरणी हिट. उद्देश्य लेंस मुहिम शुरू की है ताकि दूरी DMD से उद्देश्य लेंस फोकल लम्बाई लेंस के साथ जुड़े से मेल खाती है है. एक उलटा माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस, ऐसी है कि ध्यान केंद्रित DMD से परिलक्षित प्रकाश माइक्रोस्कोप के माध्यम से visualized किया जा सकता से नीचे रखा गया है. polymerization की सतह के लिए उद्देश्य लेंस से दूरी लगभग लेंस के काम दूरी के अनुरूप होना चाहिए. खुर्दबीन मंच पर तो इस दूरी को समायोजित करने के लिए पतले छवि ध्यान केंद्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह दूरी चुना polymerization सतह पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं. 2. ऊतक Explant संस्कृतियों के लिए दोहरी Hydrogel constructs ए DRG explant आसंजन कोट 6 अच्छी तरह से कोलेजन वर्षा – एक्स के साथ लेपित सेल संस्कृति (Corning) आवेषण, झिल्ली ही से बचने के ख्याल रख रही दीवारों. (वैकल्पिक रूप से, एक hydrophobic बाधा कलम हो. इस्तेमाल किया जा सकता) हाइड्रेट 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 1.5 एमएल एक इनक्यूबेटर में मध्यम आसंजन के साथ रात भर आवेषण. आसंजन मध्यम 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 0.5mm एल glutamine, और 20 μg / एमएल NGF के साथ neurobasal माध्यम है. हार्वेस्ट E-15 चूहे पिल्ले से भ्रूण पृष्ठीय रूट ganglia (DRG). DRG कोलेजन लेपित 6 अच्छी तरह आवेषण पर चढ़ाया जाना चाहिए के रूप में कई के रूप में चार डालने के प्रति. 2 घंटे के लिए आवेषण सेते झिल्ली को पालन DRG करने के लिए अनुमति. बी गतिशील मुखौटा photopolymerization एक डिजिटल micromirror डिवाइस (डीएमडी) व्यक्तिगत दर्पण, प्रक्षेपण टीवी में है कि करने के लिए इसी तरह की है, जो चुनिंदा दर्पण की स्थिति के आधार पर प्रकाश को दर्शाता है एक 1024 x 768 सरणी है. हमारे प्रयोजनों के लिए, DMD पैटर्न पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश photocrosslinkable hydrogels पर प्रयोग किया जाता है, एक सरल और तेजी से तरीके में निर्दिष्ट hydrogel geometries बनाने. चित्रा 1 DMD और यूवी प्रकाश पथ की स्थापना दर्शाया गया है. हालांकि हमारे DMD एक स्वसंपूर्ण इकाई है, युक्ति भी कई मौजूदा सूक्ष्मदर्शी के साथ उपयोग के लिए एकीकृत किया जा सकता है. डालने से सभी अतिरिक्त तरल निकालें, और polymerization के माध्यम अंदर डालने के 500 μL जोड़ें. Polymerization मध्यम 10% (1000 मेगावाट) खूंटी और 0.5% 2959 Irgacure neurobasal 20 μg / एमएल NGF और 1% पेन / Strep के साथ पूरक मध्यम में भंग होता है. वर्षा एक्स इलाज गिलास स्लाइड पर DMD डिवाइस के नीचे डालने प्लेस. उपयुक्त काले और सफेद छवि DMD पर "photomask" के रूप में इस्तेमाल किया जा शामिल ALP-3 बुनियादी जीयूआई कार्यक्रम के उपयोग के माध्यम से लोड करें. हमारे प्रयोजनों के लिए, एक विभाजन आकार neurite मार्गदर्शन प्रणाली के कार्यान्वयन के लिए अनुमति देने के लिए चुना गया था. दृश्य के लिए एक औंधा सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, ऊतक explants photomask उपयुक्त स्थान पर एक दृश्य प्रकाश स्रोत का उपयोग कर बंद डीएमडी को दर्शाती के साथ संरेखित करें. यूवी प्रकाश स्रोत के लिए दृश्य प्रकाश स्रोत स्विच, और खूंटी समाधान रोशन जब तक crosslinking पर्याप्त है. (दिया और 5.0 वाट / सेमी DMD पर 2 घटना, crosslinking के रूप में छोटा रूप में 55 सेकंड में पूरा किया जा सकता है है शर्तों के लिए.) डालने पर सभी चार DRG के लिए दोहराएँ. प्रत्येक डालने बाँझ DPBS और 1% पेन Strep के साथ तीन बार धोएं. सेल संस्कृति आवेषण नीचे 1.5mL मध्यम विकास जोड़ें, और एक मशीन में 30 मिनट के लिए संतुलित अनुमति देते हैं. विकास मध्यम neurobasal 2% बी 27, 1% पेन / Strep, 0.5mm एल glutamine, और 20 μg / एमएल NGF युक्त मध्यम है. सी. माध्यमिक hydrogel Puramatrix Neuronal अनुप्रयोगों के लिए, 1% Puramatrix निर्माता के निर्देशों के अनुसार बाँझ एच 2 हे में 0.15% पतला है और 1 μg / एमएल घुलनशील laminin के साथ पूरक. सभी अतिरिक्त मीडिया खूंटी voids, जो DRG explants होते, एक बाँझ कपास टिप applicator, Kimwipe, या micropipette का उपयोग कर से हटाया जाना चाहिए. Puramatrix micropipette के साथ खूंटी voids के लिए जोड़ा जाता है क्रम में ढेर बिना खाली स्थान को भरने के. शून्य मात्रा पर निर्भर करता है, आमतौर पर ~ 1 μL निर्माण प्रति प्रयोग किया जाता है. Puramatrix एक शारीरिक नमक समाधान के साथ संपर्क पर आत्म विधानसभा की प्रक्रिया तुरंत शुरू होता है, सूजन खूंटी यानी, लेकिन मध्यम विकास की 1.5 एमएल डालने के नीचे जोड़ा जाता है और एक घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखा कुल जमाना सुनिश्चित. प्रारंभ में, Puramatrix थोड़ा अम्लीय है, तो एक घंटे के बाद मीडिया को बदलने के लिए पीएच संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं. मीडिया परिवर्तन लगभग हर 48 घंटे के लिए आवश्यक हैं. सावधान रहना है कि सभी मीडियाडालने के नीचे जोड़े, यंत्रवत् कमजोर Puramatrix की अखंडता की रक्षा. Agarose Agarose neuronal अनुप्रयोगों के लिए, मध्यम विकास में एक 1% समाधान के लिए पतला है और एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जब तक agarose पूरी तरह घुल (~ 1 घंटा). समाधान तो 1 μg / एमएल घुलनशील laminin के साथ पूरक है. सभी अतिरिक्त मीडिया खूंटी voids से हटाया जाना चाहिए. Agarose खूंटी voids में जोड़ा जाता है क्रम में ढेर बिना खाली स्थान को भरने के. शून्य की मात्रा पर निर्भर करता है, आमतौर पर ~ 1 μL निर्माण प्रति प्रयोग किया जाता है. मध्यम विकास की 1.5 एमएल 6 अच्छी तरह से एक थाली में पूर्व – ठंडा (8 डिग्री सेल्सियस) है, और agarose युक्त आवेषण ठंडा मीडिया के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और एक रेफ्रिजरेटर में 8 ° C पर कम से कम तीन मिनट के लिए रखा करने के लिए agarose की अनुमति जेल. अंत में, आवेषण पूर्व गर्म मध्यम विकास की 1.5 एमएल (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और 37 इनक्यूबेटर में रखा ° सी, मीडिया हर 48 घंटे में आवश्यक परिवर्तन के साथ. 3. दोहरी Hydrogel 3D सेल इनकैप्सुलेशन दोहरी hydrogel encapsulation के उपयुक्त है जब किसी भी स्वयं कोडांतरण जेल का उपयोग कर. photocrosslinkable जेल, इस मामले में खूंटी में, Puramatrix या agarose उदाहरण के लिए स्वयं कोडांतरण जेल के ज्यामितीय प्रस्तुति के लिए एक संरचनात्मक समर्थन के रूप में कार्य करता है. कुछ तरीकों की, विशेष रूप से जेल और photomask पसंद के प्रकार, विशेष रूप से वांछित आवेदन पर निर्भर करेगा. DMD पर एक उपयुक्त मुखौटा लोड. हमारे आवेदन, सेल अस्तित्व के लिए, हम बस Puramatrix कक्षों की इमेजिंग में सहायता के एक बेलनाकार प्रस्तुति चुना. संकेतन सेल के अध्ययन के शोधकर्ताओं ने एक पूरक ज्यामिति में रुचि रखते chemotactic अणुओं के प्रसार के लिए अनुमति हो सकती है. इसके अतिरिक्त, एक धमनी का एक मोटा सन्निकटन रक्त वाहिका अनुसंधान करने के लिए संभव आवेदन का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया था. वर्षा एक्स के साथ एक पॉलिएस्टर सेल संस्कृति सम्मिलित करते हैं, और जगह वर्षा X लेपित स्लाइड पर DMD तहत की दीवारों समझो. Polymerization के माध्यम से 500 μL सम्मिलित करने के लिए जोड़ें. 55 सेकंड के लिए यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के खूंटी crosslinking प्रेरित. बाँझ DPBS और 1% पेन Strep के साथ तीन बार धोएं. खूंटी voids से सभी अतिरिक्त मीडिया निकालें. नीचे एक गोली में वांछित घनत्व कोशिकाओं स्पिन. केयर सेल गोली से सभी मध्यम मिश्रण करने के लिए पहले निकालने के लिए, के रूप में आत्म विधानसभा Puramatrix तुरंत एक नमक समाधान के साथ संपर्क पर शुरू होता है लिया जाना चाहिए. 0.15% बाँझ एच 2 हे में पतला Puramatrix अंदर कोशिकाओं को निलंबित 10% sucrose के साथ पूरक . Puramatrix / खूंटी में voids अंदर सेल / sucrose के मिश्रण इंजेक्षन. डालने के नीचे मध्यम विकास की 1.5 एमएल जोड़ें, और इनक्यूबेटर अंदर एक घंटे के लिए जेल के लिए अनुमति देते हैं. एक घंटे के बाद मीडिया को बदलें, और उसके बाद हर 48 घंटे के ~. 4. सिंगल Hydrogel 3D सेल इनकैप्सुलेशन एक एकल hydrogel encapsulation जहां कोशिकाओं को एक photocrosslinkable hydrogel के अंदर जांच कर सकते हैं किसी भी स्थिति के लिए उपयुक्त होगा. DMD पर एक उपयुक्त मुखौटा लोड. सेल अस्तित्व के अध्ययन के लिए, हम फिर से एक बुनियादी परिपत्र मुखौटा चुना एक सिलेंडर का प्रतिनिधित्व करने के लिए. 4 विधि में दिखाया गया है उन लोगों के लिए समान मुखौटे फिर उचित अनुसंधान के क्षेत्र के लिए लागू किया जा सकता है. वर्षा एक्स के साथ एक पॉलिएस्टर सेल संस्कृति सम्मिलित करते हैं, और जगह वर्षा X लेपित स्लाइड पर DMD तहत समझो. 10% खूंटी समाधान के लिए किसी भी वांछित एकाग्रता कक्ष सीधे जोड़ा जा सकता है, अच्छी तरह से मिश्रण समरूप वितरण सुनिश्चित. Polymerization के माध्यम से 500 μL सम्मिलित करने के लिए जोड़ें. 55 सेकंड के लिए यूवी प्रकाश के लिए जोखिम के खूंटी crosslinking प्रेरित. बाँझ DPBS और 1% पेन Strep के साथ तीन बार धोएं. दोनों नीचे और डालने के शीर्ष पर मध्यम विकास के साथ भरें, हर ~ 2 दिन बदल रहा है. 5. पतला फिल्मी Hydrogel polymerization DMD पर एक उपयुक्त मुखौटा लोड. वर्षा – एक्स के साथ एक कोलेजन लेपित पॉलिएस्टर सेल संस्कृति सम्मिलित करते हैं, और वर्षा X लेपित स्लाइड पर जगह समझो. बस डालने (~ 6 अच्छी तरह से थाली आवेषण के लिए 250-300 μL) के तल को कवर पर्याप्त polymerization के माध्यम जोड़ें. मीडिया कमरे के तापमान पर 30-45 मिनट के लिए डालने झिल्ली तर करने की अनुमति दें. एक micropipette या Kimwipe साथ डालने से अधिक polymerization के माध्यम निकालें. पूरी तरह से डालने के नीचे कवर पारदर्शी यूवी तेल की एक पर्याप्त राशि जोड़ें. डालने के कमरे के तापमान पर 15-30 मिनट के लिए बैठते हैं, polymerization के माध्यम saturating डालने झिल्ली के ऊपर एक अलग परत के रूप में तेल के लिए काफी लंबे समय की अनुमति दें. डालने और DMD के तहत स्लाइड रखें. पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क द्वारा खूंटी crosslinking प्रेरित. खूंटी परत के thinness के कारण, crosslinking 5.0 वाट DMD / 2 सेमी घटना के रूप में छोटा रूप में 15 सेकंड में पूरा किया जा सकता है. <li> बाँझ DPBS और 1% पेन Strep के साथ सम्मिलित करने के लिए तीन बार धोएं. (यदि एक तेल अवशेषों के हठ एक चिंता का विषय है, बीच 20 (1%) के रूप में इस तरह के एक हल्के साबुन धोने बफर जोड़ा जा सकता है.) 6 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति की थाली में डालने स्टोर. मध्यम विकास निलंबित कोशिकाओं को जोड़ें, एकाग्रता में वांछित, और सेल संस्कृति डालने के अंदर सेल निलंबन की पर्याप्त मात्रा विंदुक वांछित सेल घनत्व प्राप्त. फिर डालने के नीचे पर्याप्त मध्यम विकास के लिए पूरी तरह से सेल व्यवहार्यता (~ 1.5 एमएल) को बनाए रखने में जोड़ें. के बाद 48 घंटे बीत चुके हैं, बाँझ DPBS और 1% पेन Strep के साथ सम्मिलित करने के लिए तीन बार धोने के लिए किसी भी unadhered कोशिकाओं बेदखल. लगभग हर 48 घंटे में एक बार मीडिया बदलें. 6. प्रतिनिधि परिणाम दोहरी hydrogel के उदाहरण constructs DRG explants युक्त चित्रा 2 में दिखाया जाता है. सूचना है कि सेलुलर प्रवास और neurite विस्तार दोहरी hydrogel के सेल अनुमोदक क्षेत्र का निर्माण करने के लिए सीमित है. चित्रा 3 dissociated दोहरी hydrogel constructs अंदर इसी तरह समझाया कोशिकाओं दर्शाया गया है. DMD photomask के गतिशील स्वभाव के कारण, encapsulation के लिए उपलब्ध ज्यामिति और प्रकाशिकी के आयामों और संकल्प के द्वारा ही सीमित है. सेल encapsulation के एक एकल photopolymerizable hydrogel, खूंटी के अंदर भी संभव था, और एक व्यवहार्यता / रहते मृत परीक्षण प्रदर्शन किया गया था के रूप में चित्रा 4 में evidenced. खूंटी में इनकैप्सुलेशन एक उदाहरण के रूप में ही मतलब है, के रूप में खूंटी तंत्रिका कोशिकाओं के लिए एक आदर्श वातावरण का प्रतिनिधित्व नहीं करता है. इसलिए, सेल व्यवहार्यता हमारे खूंटी constructs में एहसास जाहिर है कम है. अंत में, सेल संस्कृति आवेषण पर एक नमूनों कोशिका आसंजन के लिए प्रतिबंधात्मक परत के रूप में पतली खूंटी फिल्मों का उपयोग करने के उदाहरण चित्रा 5 में दिखाया गया है. इसके अतिरिक्त, संभव है "" बुरा परिणाम के उदाहरण चित्रा 6 में की पेशकश कर रहे हैं. परिणाम केवल हमारी प्रयोगशाला में विकसित की विधियों की संभव का उपयोग करता है की एक छोटा सा अंश का प्रतिनिधित्व करते हैं. वे आसानी बहुमुखी प्रतिभा, और हमारे दृष्टिकोण की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करने के लिए होती हैं, और "सिद्धांत का सबूत" के रूप में इलाज किया जा सकता है और शोधकर्ताओं के लिए विकसित करने के लिए अपने खुद के संभव रूपांतरों. चित्रा 1 प्रकाश photolithography के लिए इस्तेमाल किया पथ के योजनाबद्ध चित्रण. इनसेट: यूवी प्रकाश 45 °, और दर्पण सरणी के विमान से नीचे 24 ° का एक कोण पर DMD illuminates. चित्रा 2. लेबल दोहरी hydrogel constructs युक्त DRG में विकास और प्रसार . ई.) polymerized खूंटी constructs (ग्रे) बीटा III (हरा) ट्यूबिलिन, DAPI दाग सेल नाभिक (नीला) के साथ लेबल neurites के साथ चित्रित छवियाँ. DRG explants Puramatrix में समाहित कर रहे हैं और विभाजन (ओं) की ओर बढ़ रहा है neurites के साथ पैटर्न के परिपत्र क्षेत्रों में स्थित है. चित्रा 3 दोहरी hydrogel मध्यम विकास में 48 घंटे के बाद calcein AM, एक जीवित सेल मार्कर के साथ लेबल की कोशिकाओं से युक्त constructs. ई.) विभिन्न खूंटी आकार, अलग DRG न्यूरॉन्स (~ 5×10 3 कोशिकाओं / एमएल) से युक्त Puramatrix के साथ भरा. चित्रा 4 सिंगल hydrogel Calcein (हरा) AM और मृत कोशिकाओं मध्यम विकास में 24 घंटे के बाद ethidium homodimer 1-(लाल) के साथ लेबल (5×10 3 कोशिकाओं / एमएल) के साथ लेबल रहते कोशिकाओं से युक्त निर्माण. चित्रा 5 सेल प्रतिबंधात्मक खूंटी "परीक्षा पैटर्न" करने के लिए चुनिंदा पारगम्य का समर्थन करता है कोलेजन लेपित झिल्ली को dissociated कोशिकाओं पालन का उपयोग कर एक पतली फिल्म के रूप में polymerized. ए, बी) लाइव कोशिकाओं Calcein AM (हरा) के साथ 48 घंटे के बाद चिह्नित कर रहे हैं, जबकि मृत कोशिकाओं ethidium homodimer 1-(लाल) के साथ लेबल रहे हैं. न्यूनतम कोशिका आसंजन के क्षेत्र में पतली खूंटी फिल्म युक्त होता है. चित्रा 6 अवांछनीय परिणामों के प्रतिनिधि छवियाँ. ए) खूंटी की आंशिक polymerization, एक व्यर्थ खूंटी करने के लिए अग्रणी का निर्माण. अनुचित polymerization के पूर्व बहुलक मध्यम, polymerization के माध्यम से अपर्याप्त मात्रा अपर्याप्त यूवी जोखिम या प्रकाशिकी के अनुचित ध्यान में एक meniscus की उपस्थिति के कारण हो सकता है. बी) बीटा III (हरा) ट्यूबिलिन, DAPI दाग सेल नाभिक (नीला) के साथ लेबल neurites के साथ चित्रित छवि polymerized खूंटी constructs (ग्रे). neurites नमूनों खूंटी चैनलों के बाहर विकसित करने में सक्षम थे. इस बार हालत में होता है कि इंजेक्शन के दौरान खूंटी भाग के शीर्ष पर Puramatrix overflows.

Discussion

इस के साथ साथ वर्णित विधि किसी भी सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेल संस्कृति प्रणालियों की मांग अन्वेषक द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है. सिद्धांततः, photopolymerizable उपलब्ध hydrogels के विस्तृत विविधता के कारण, पर्यावरण के लिए किसी भी सेल सहित पूरे ऊतक explants प्रकार, के साथ प्रयोग के लिए अनुमति देने के लिए सिलवाया किया जा सकता है. इसके अलावा, दोहरी hydrogel प्रणाली स्वयं polymerizing hydrogels, जो अपने दम पर अनाकार आकार के रूप में करते हैं की प्रस्तुति में सुधार स्थानिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. जिसके परिणामस्वरूप "2.5D" micropatterned hydrogel constructs तंत्रिका विकास के लिए एक 2d विन्यास है कि सक्षम बनाता है सुविधाजनक सूक्ष्म मूल्यांकन में प्रस्तुत एक 3 डी मैट्रिक्स प्रदान करते हैं. सब्सट्रेट जिस पर जैल polymerized हैं भी, विविध किया जा सकता है प्रयोगात्मक डिजाइन में अधिक से अधिक नियंत्रण के लिए अनुमति देता है. हमारे तरीकों सेल संस्कृति पारगम्य समर्थन के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं, के रूप में हम गिलास स्लाइड (नहीं दिखाया डेटा है) पर polymerization की तुलना में सुधार व्यवहार्यता (चित्रा 4) के रूप में देखा है. हालांकि, अन्य polymerization सतहों और विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है: कांच पर निर्माण स्लाइड microfluidics प्रयोगों या उदाहरण के लिए सेल कुल फार्मेशनों, में प्रयोग किया जाता है.

इन संस्कृति प्रणालियों के साथ हमारा अनुभव कठिनाई के संभावित क्षेत्रों की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया गया है. सबसे पहले, सावधान तकनीक constructs के बाँझपन बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं. DMD सेटअप के भारी प्रकृति के कारण, यह मुश्किल है polymerization के चरणों बाँझ शर्तों के तहत संचालित है. इस मुद्दे का मुकाबला करने के लिए, कुल्ला तरीकों में वर्णित कदम मददगार है, और एंटीबायोटिक दवाओं सभी मीडिया में इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, अंतिम मोटाई और polymerized निर्माण के आकार के अत्यधिक पूर्व बहुलक मिश्रण के तरल पदार्थ के व्यवहार पर निर्भर है, और एक meniscus के उपस्थिति जेल constructs कि बहुत पतले या अधूरे polymerized (चित्रा 6) में परिणाम कर सकते हैं. दो कदम सेल संस्कृति आवेषण के अंदर एक meniscus के गठन को कम करने के लिए लिया जा सकता है है. मोटी hydrogels (> 200 सुक्ष्ममापी), डालने के अंदर दीवार के आसपास वर्षा एक्स के एक सरल कोटिंग पर्याप्त है. हालांकि, के रूप में संक्षेप में ऊपर पतली constructs (<200 सुक्ष्ममापी) के लिए में वर्णित है, एक तेल की परत करने के लिए दोनों meniscus को कम करने और मुक्त कट्टरपंथी polymerization के ऑक्सीजन शमन नकारना की आवश्यकता है. संकल्प सुविधा आकार में कमी के साथ तेजी से मोटा जैल एहसास के साथ, मोटाई पर निर्भर हो पाया था. संकल्प भी पर निर्भर करता है कि सुविधा hydrogel में एक सकारात्मक या नकारात्मक राहत का प्रतिनिधित्व विविध. हालांकि, हम ~ 100 केवल माइक्रोस्कोप उद्देश्यों का उपयोग कर के रूप में प्रकाशिकी ध्यान केंद्रित सुक्ष्ममापी पैमाने पर न्यूनतम सुविधा आकार के साथ constructs के लिए पर्याप्त संकल्प हासिल की.

हमारे प्रयोगों से पता चला है कि दोहरी hydrogel यहाँ वर्णित constructs neurite विकास और मार्गदर्शन के बुनियादी मॉडल में इन विट्रो के गठन के लिए एक उत्कृष्ट आधार का प्रतिनिधित्व करते हैं. micropatterning कार्यरत तकनीक मौजूदा ^18,19 तरीकों की एक रूपांतर है, लेकिन हमारे सेट अप एक सरल डिजाइन को लागू करने के लिए पर बल दिया और सेल संस्कृति आवेषण पर दोहरी hydrogel constructs के उत्पादन के लिए अनुकूलित किया गया था, सेल संस्कृति आवेषण सेल व्यवहार्यता के रूप में अच्छी तरह से सुधार के लिए महत्वपूर्ण थे के रूप में पहले से पक्षपाती ऊतक explants आसपास crosslinking. दिखाए गए परिणामों के दायरे हमारी प्रयोगशाला के हितों के द्वारा सीमित है, तथापि, हम विश्वास है कि इस प्रकाशन में वर्णित विधि एक अपेक्षाकृत सस्ते, 3 डी सेल संस्कृति के निर्माण के लिए जल्दी और उपयोग करने के लिए आसान विधि के लिए खोज रहे शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी साबित होगा मॉडल.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Digital Micromirror Device		Texas Instruments	DLPD4X00KIT
Collagen Coated Transwell Permeable Support		Corning	3491	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Polyester Transwell Permable Support		Corning	3412	Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript
Neurobasal Medium		Invitrogen	21103-049
Fetal Bovine Serum		Invitrogen	16000-036
L-glutamine		Invitrogen	25030-164
Nerve Growth Factor		Invitrogen	13257-019
Pen/Strep		Invitrogen	15140-122
B-27 Supplement		Invitrogen	17504-044
DPBS		Invitrogen	14190-250
Puramatrix		BD Biosciences	354250
PEG 1000		Polysciences, Inc.	15178
Irgacure 2959		Ciba Specialty Chemicals	0298913AB
Oil		Have used both canola oil and silicon oil		Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation
OmniCure Series 1000		Exfo
Rain-X