Enkla tekniker finns beskrivna för snabb produktion av mikrofabricerade neurala kultur system som använder en digital micromirror device för dynamisk mask projektion litografi på regelbundna substrat cellkultur. Dessa kulturen system kan vara mer representativ för naturliga biologiska arkitektur, och de beskrivna teknikerna skulle kunna anpassas för många tillämpningar.
Allt fler mönstrade cellodling miljöer bli en relevant teknik för att studera cellulära egenskaper, och många forskare tror på behovet av 3D-miljöer att representera in vitro-försök som bättre efterliknar in vivo kvaliteter 1-3. Studier på områden som cancerforskning 4, neurala ingenjörskonst 5, hjärt fysiologi 6, och cell-matrix interaktioner 7,8 har visat cellens beteende skiljer sig avsevärt mellan traditionella cellslager kulturer och 3D-konstruktioner.
Hydrogeler används som 3D-miljöer på grund av sin mångfald, mångsidighet och förmåga att skräddarsy molekylära sammansättning genom funktionalisering 9-12. Många olika tekniker finns för skapandet av konstruktioner som cell-stödjande matriser, inklusive electrospinning 13, elastomer frimärken 14, bläckstråleutskrifter 15, additiv photopatterning 16, statisk fotomasker projektion-litografi 17 och dynamisk mask microstereolithography 18. Tyvärr är dessa metoder medför flera produktionssteg och / eller utrustning inte är lätt att anpassa till konventionella celler och vävnader metoder kultur. Tekniken som används i detta protokoll anpassar de två sistnämnda metoderna, med hjälp av en digital micromirror device (DMD) för att skapa dynamiska fotomasker för crosslinking geometriskt specifika poly-(etylenglykol) (PEG) hydrogeler, inducerad genom UV inlett fri radikal polymerisering. Den resulterande "2.5D" strukturer ger ett begränsat 3D-miljö för neural tillväxt. Vi använder en dual-hydrogel tillvägagångssätt, där PEG fungerar som en cell-restriktiv regionen levererar struktur till en annars formlösa men cell-tillåtande självorganiserande gelé från antingen Puramatrix eller agaros. Processen är en sammanfattning enkelt ett steg tillverkning som är mycket reproducerbar och kan enkelt anpassas för användning med konventionella metoder cellkultur och substrat.
Hela vävnad explants, t.ex. embryonala dorsalrotsganglier (DRG), kan införlivas i den dubbla hydrogelen konstruktioner för experimentella analyser som neurite utväxt. Dessutom kan skiljas celler inkapslade i photocrosslinkable eller egen polymerisation hydrogel eller selektivt anslutit sig till genomsläppliga stödja membran med hjälp av cell-restriktiv photopatterning. Med hjälp av DMD skapade vi hydrogel konstruktioner upp till ca 1 mm tjock, men tunn film (<200 mikrometer) var PEG strukturer begränsas av syre härdning av fria radikaler polymerisationsreaktion. Vi utvecklade därefter en teknik som använder ett lager av olja ovanför polymerisation vätska som tillåts tunna polymerisation PEG struktur.
I detta protokoll, beskriver vi ett snabbt skapa 3D-hydrogel system för produktion av mikrofabricerade neurala cell-och vävnadskulturer. Den dubbla hydrogelen visat konstruerar representerar häri mångsidig in vitro-modeller som kan vara användbar för studier i neurovetenskap med cellöverlevnad, migration och / eller neurite tillväxt och vägledning. Eftersom protokollet kan fungera för många typer av hydrogeler och celler, de potentiella tillämpningar är både varierande och omfattande.
Den metod som beskrivs här kan användas av någon utredare som söker enkla och reproducerbara system cellodling. Teoretiskt, på grund av det stora utbudet av photopolymerizable hydrogeler tillgänglig, kan miljön anpassas för att möjliggöra för användning med alla celltyper, inklusive hela vävnad explants. Dessutom ger det dubbla hydrogelen systemet för förbättrad fysisk kontroll i presentationen av själv-polymerisation hydrogeler, som tenderar att bilda amorfa former på egen hand. Den resulterande "2.5D" micropatterned hydrogel konstruktioner ger en 3D-matris för neurala tillväxt som presenteras i en 2D-konfiguration som ger enkel mikroskopisk utvärdering. Underlaget som geler polymeriserat kan också varieras, vilket möjliggör större kontroll i experimentell design. Våra metoder är optimerade för användning med genomträngliga cellodling stödjer, som vi sett förbättrade lönsamheten (Figur 4) jämfört med polymerisation på glas diabilder (data visas inte). Dock kan andra polymerisation ytor vara mer tillämpliga för olika användningsområden: tillverkning på glas bilderna används i mikrofluidik experiment eller cell formationer aggregat, till exempel.
Vår erfarenhet av dessa kultur-system har lett till att identifiera potentiella problemområden. Först är noga med teknik som krävs för att bibehålla sterilitet konstruktioner. På grund av den skrymmande typ av DMD setup, är det svårt att driva polymerisation steg under sterila förhållanden. För att bekämpa detta problem, är skölj steg som beskrivs i de metoder hjälpsamma, och antibiotika bör användas i alla medier. Dessutom är den slutliga tjockleken och formen på polymeriserade bygga starkt beroende av vätska beteende före polymer blandning och närvaron av en menisk kan resultera i gel konstruktioner som är för tunna eller ofullständigt polymeriserade (Figur 6). Två åtgärder kan vidtas för att minimera bildandet av en menisk inne insatser cellkultur. För tjock hydrogeler (> 200 mikrometer), en enkel beläggning av Rain-X runt insidan av insatsen är tillräcklig. Men som kortfattat beskrivs ovan, för tunna konstruktioner (<200 mikrometer), är en olja skikt som krävs för att både minimera menisken och förneka syre härdning av fri radikal polymerisering. Upplösning befanns vara beroende av tjocklek, med en minskning av karaktäristisk storlek insåg med allt tjockare geler. Upplösningen varierade också beroende på om funktionen representerade en positiv eller negativ lättnad i hydrogel. Däremot nådde vi en tillräcklig upplösning för konstruktioner med minsta karaktäristisk storlek på skalan av ~ 100 ìm med enbart mikroskop mål som fokuserar optik.
Försöken har visat att den dubbla hydrogelen konstruktioner som beskrivs här utgör en utmärkt grund för bildandet av grundläggande in-vitro modeller för neurite tillväxt och vägledning. Den micropatterning Tekniken som används är en anpassning av befintliga metoder 18,19, men vår inställning betonade en enkel att implementera design och var optimerad för produktion av produkter med dubbla hydrogel konstruktioner på skären cellkultur, cellodling insatser var viktiga för att förbättra cellviabiliteten samt som crosslinking runt tidigare anhängare vävnad explants. Omfattningen av visat resultat begränsas av intressen vårt laboratorium, men vi tror att de metoder som beskrivs i denna publikation kommer att vara användbar för forskare söker efter en relativt billig, snabb och lätt att använda metoden för tillverkning av 3D-cellodling modeller.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka laboratoriet av professor Anthony Windebank för att dela sin expertis på DRG dissekering och kultur, samt professor Shaochen Chen för bra diskussioner om DMD setup. Denna forskning har finansierats delvis av Tulane University och bidrag från Louisiana Board of Regents (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) och NIH (NS065374).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Digital Micromirror Device | Texas Instruments | DLPD4X00KIT | ||
Collagen Coated Transwell Permeable Support | Corning | 3491 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Polyester Transwell Permable Support | Corning | 3412 | Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript | |
Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | ||
Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-036 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-164 | ||
Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | ||
Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
B-27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | ||
DPBS | Invitrogen | 14190-250 | ||
Puramatrix | BD Biosciences | 354250 | ||
PEG 1000 | Polysciences, Inc. | 15178 | ||
Irgacure 2959 | Ciba Specialty Chemicals | 0298913AB | ||
Oil | Have used both canola oil and silicon oil | Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation | ||
OmniCure Series 1000 | Exfo | |||
Rain-X |