1. Isolering av Human CD4 + T-celler från perifert blod (se figur 1) Perifert venöst blod (40 till 60 MLS) samlas in i Vacutainer Rör innehållande natrium heparin (Becton Dickenson). Perifert blod överförs sedan från Vacutainer Rör till 50 koniska mL polystyren rör (20 mL blod per rör). RosetteSep CD4 + T-cell isolering reagens (StemCell Technologies) läggs i en 1 mL volym för att inte mer än 20 ml blod i ett 50 ml rör och blandas väl. Blandningen sedan inkuberas vid 20-25 ° C i 20 minuter. Efter 20 minuter, kalcium och magnesium-fria (CMF) fosfatbuffrad koksaltlösning [PBS (HyClone] w / 2% värmeinaktiveras (56 ° C i 30 minuter) fetalt bovinserum [FBS (HyClone)] skall läggas till de blandningar för att nå en slutlig volym på 40 ml. Den utspädda blandningar (30 ml) är sedan lager på toppen av 15 mL Lymphocyte Separation Medium [LSM (Cellgro)] i färska 50 ml polystyren koniska rör. Den 50 ml rör sedan centrifugeras vid 1200 x g i 20 minuter med bromsen avstängd. Den 50 ml rör tas bort från centrifugen noga, så att gränssnittet mellan LSM och medelstora inte störs. Cellerna i gränssnittet samlas in med en 10 ml pipett och placeras i frisk 50 mL polystyren koniska rör. De insamlade gränssnitt späds med PBS w / 2% FBS till en slutlig volym på 50 ml. Den 50 ml rör som innehåller den utspädda gränssnitten centrifugeras vid 1200 x g under 10 minuter med broms på. Efter centrifugering, är supernatanterna aspirerade och pellets återsuspenderade i 10 ml av PBS w / 2% FBS. Den cellsuspensioner sedan kombineras till en enda 50 ml koniska rör och spädas till 50 MLS med PBS w / 2% FBS. Röret med den kombinerade cellsuspension är centrifugeras vid 300 x gi 10 minuter för att avlägsna alla återstående LSM. Supernatanten aspireras och pellets är då suspenderade i 10 ml av RPMI-1640 medium (HyClone) med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin (HyClone) och 2 mm L-glutamin (CellGro ) (RPMI-komplett) och räknas med hjälp av en hemocytometer. Koncentrationen av renade CD4 + T-celler justeras sedan 3×10 6 / ml med RPMI-klar. CD4 + är sedan stimuleras genom odling av dem med anti-CD3/anti-CD28 kopplade till pärlor [T-Cell Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] på en tre kulor per cell-talet för 72 timmar vid 37 ° C i en 5% C0 2 fuktad inkubator. 2. Infektion av CD4 + T-celler med HIV-1 (se figur 1) Cellsuspension innehåller stimuleras CD4 + T-celler tas bort från den kultur plattan och räknade med en hemocytometer. CD4 + T-celler (~ 2×10 6) läggs till ett 15 ml koniskt rör för användning som osmittad kontroll. Resten av CD4 + T-cellsuspension placeras i ett 50 ml koniskt rör för infektion. Rören innehåller CD4 + T-cellsuspensioner centrifugeras vid 300 x g i 10 minuter och den kultur supernatanten aspireras. Stimulerade CD4 + T-celler är suspenderade direkt i kultur vätskor som innehåller virioner och sedan spinn-infekterade vid 1200 x g 2 timmar vid 20-25 ° C 9. Normalt har vi infektera CD4 + T-celler med en mångfald av infektion (MOI) för 5 för en replikering bristfällig hiv-stam (t.ex. DHIV-3) eller en MOI på 0,01 för ett replikationskompetenta virus (t.ex. HIV-1 NL4 / 3) . Slutliga volymen är oviktiga, utan tuber måste vara balanserad för centrifugering. Polybrene (Santa Cruz) läggs till den kultur vätskan innan spinfection till en slutlig koncentration på 10 mikrogram / ml. Efter avslutad spinfection är supernatanterna bort och celler resuspenderas i en cell densitet på 3×10 6 / ml RPMI-komplett kompletteras med 100 E / ml IL-2. Den infekterade och oinfekterade celler är kultur för 72 timmar, om ett inaktiverat virus som användes för att infektera cellen eller 5-7 dagar om en replikationskompetenta virus användes för att infektera cellerna. Media bör bytas var 48 timmar under kultur. 3. Isolering av mänskliga naturliga mördarceller från perifert blod Perifert venöst blod (~ 100 ml) samlas in från samma givare som används för att isolera de CD4 + T-celler i Vacutainer Rör innehållande natrium heparin (Becton Dickenson). Blodet överförs sedan från Vacutainer Rör i 50 ml koniska rör i 20 ml. Den Vacutainer Rör sedan tvättas med 8 ml CMF Hanks Balanced Salt Solution [HBSS (Hyclone)] och tvättar överförs till 50 ml conicals containing den 20 mL perifert blod. Den resulterande volymen i varje 50 ml konisk är 35 ml. Den utspädda blodet sedan lager på toppen av 15 mL LSM i en fräsch 50 ml koniska rör och rören centrifugeras vid 400 x g i 30 minuter med bromsen avstängd. Rören är försiktigt bort från centrifugen och den resulterande gränssnittet mellan LSM och medelstora skördas från varje rör med hjälp av en 10 ml pipett och placeras i färska 50 ml koniska rör. Den cellsuspensioner tvättas en gång med CMF HBSS (centrifugeras vid 400 x g i 15 minuter med bromsen på). Efter den första tvätta supernatanterna tas bort och de resulterande pellets kombineras till en enda 50 ml koniska och tvättas två gånger med CMF HBSS (centrifugeras vid 30 x gi 10 minuter med broms på) för att avlägsna alla återstående LSM. Efter den sista tvättningen pelleten är resupended i 10 ml ACK lyseringsbuffert (150 mm NH 4 Cl, 1,0 mm KHCO 3 och 0,1 mM EDTA pH 7,3) och inkuberas vid rumstemperatur (20-25 ° C) i 5 min. Detta steg är nödvändigt för att avlägsna kontaminerande erytrocyter från perifera mononukleära blodceller (PBMC). Efter 10 minuter. 40 ml av CMF PBS läggs till cellsuspension för att stoppa lys reaktionen. Röret med cellsuspensionen innehåller PBMC och lyserade erytrocyter sedan centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. Supernatanten tas bort och pellets är suspenderade i 5 ml PBS med 2% FBS och 2 mM EDTA och räknas med hjälp av en hemocytometer. Den naturliga mördarceller (NK) celler därefter isoleras från PBMC med en NK-Kit Cell Isolering [negativt urval-mänskliga (Miltenyi Biotec)] enligt tillverkarens anvisningar. Den genomströmning från kolumnerna samlas i 15 ml rör och rören centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. Den supernatanterna tas bort och pellets återsuspenderade. Den återsuspenderade pellets är kombinerade i ett rör i en total volym av 1 ml Iscove ändrade Dulbecco medellång [IMDM (Gibco)] kompletterad med 10% AB + värmeinaktiverad (56 ° C i 30 minuter) humanserum (HS) och räknas med en hemacytometer. Volymen cellsuspension justeras med IMDM w/10% HS så att den slutliga tätheten av NK-celler är 3×10 6 / mL. Cellsuspensionen delas i hälften. En uppsättning av NK-celler tar emot 200 U / ml rekombinant humant interleukin-2. Den andra uppsättningen celler som finns kvar i medium utan cytokin behandling. NK cell kulturerna inkuberas därefter över natten vid 37 ° C, 5% CO 2 Den resulterande NK-celler används sedan som effektorceller celler för antingen en CD107a degranulering analysen eller 51 Cr-släpp-analysen. 4. Rening av HIV-1-infekterade celler (se figur 1) Kulturen vätskor som innehåller infekterade cellerna tas bort från plattorna och centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. Supernatanten aspireras och pellets är suspenderade i 2 ml PBS med 2% FBS och 2 mM EDTA och celler räknade med en hemocytometer. Infekterade celler som inte innehåller HIV-1 är isolerade från de som hysa viruset genom att utnyttja det faktum att HIV-1 ner modulerar CD4. För detta ändamål CD4-positiva Isolation Kit (Invitrogen) används enligt tillverkarens anvisningar med undantag för att en en-CD4 pärla per cell utväxling. Vid borttagning av CD4 + T-celler, är de döda cellerna bort från det renade cellpopulation hysa viruset med hjälp av en död Kit Cell borttagning (Miltenyi Biotec) enligt tillverkarens anvisningar. Den genomströmning efter döda celler avlägsnas i spalterna är centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. Supernatanten bort, återsuspenderade pellets i 1 ml RPMI-komplett och cellerna räknas. Det renade infekterade cellerna är nu redo för att användas som mål i en CD107a degranulering analysen eller 51 Cr-släpp-analysen. 5. CD107a degranulering-analys (se figur 2) NK cellkulturer tas bort från plattorna och cellsuspension räknas. NK cellsuspensioner är centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. NK-celler är suspenderade i RPMI-klar och den slutliga koncentrationen justeras till 10 6 celler / ml. Cellsuspensioner från den isolerade infekterade och oinfekterade T-celler som genereras i ovanstående steg centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med broms på. Supernatanterna tas bort och pellets suspenderade i RPMI-komplett på 2×10 6 celler / ml. K562 celler används som positiva celler kontroll målet, eftersom de är mycket mottagliga för NK lys. THan celler centrifugeras vid 300 x gi 10 minuter med broms på, är supernatanterna bort och pellets suspenderade i RPMI-komplett på 2×10 6 celler / ml I en 96-V-botten och platta 100 MCL mål och 100 MCL effektenheter läggs till brunnarna. En väl innehåller 100 mcLof effektenheter och 100 MCL av medium utan målceller kommer att användas för icke-specifika NK cell degranulering. Till varje brunn 10 mcLFITC-konjugerat anti-CD107a (BDIS) tillsätts. Plattan är centrifugeras sedan vid 20 x g 2 minuter med broms på. Den centrifugeras plattan inkuberas i 4 timmar vid 37 ° C och 5% CO 2. Efter inkubation plattan centrifugeras vid 400 x g 5 minuter med broms på. Supernatanten bort från pelleten. Varje väl färgas sedan med följande panel av fluorokromkonjugerade antikroppar på is i 20 minuter i sammanlagt 100 mcLof flöde buffert (PBS w / 2% FBS och 0,1% NaN 3) anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-konjugerade (Biolegend)] anti-CD56 [APC (Biolegend)] Efter 20 minuters inkubation, är 200 MCL av flödet buffert till varje brunn och skivan är centrifugeras vid 400 x g 5 minuter med broms på. Flödet bufferten är sedan försiktigt aspireras från varje brunn med en 2 ml aspirerande pipett utrustad med en 200 MCL mikropipett spets samtidigt se till att inte störa pelleten. Steg 15 och 16 upprepas ännu en gång. Pellets är suspenderade i 200 MCL 1% paraformaldehyd i CMF PBS. Den cellsuspensioner överförs sedan flyta rör. Total volym tas upp till 300 MCL genom att lägga ~ 100 MCL på 1% paraformaldehyd i CMF PBS till varje rör. Händelserna (2×10 4) motsvarande NK-celler samlas in av en flödescytometer med FACS DIVA (BDIS) programvara för förvärv och analyseras med hjälp av Flow Jo programvara (TreeStar). 6. CD107a gating strategi (se figur 3) Enda cell grindar skapas med hjälp av en forward scatter höjd (FSC-H) vs Forward Scatter bredd (FSC-W) komplott. För storlek kontra granularitet tomt ett FSC vs sidospridning (SSC) plot skapas på en enda cell grinden. Vanligtvis lymfocyter har relativt låg detaljnivå och medelstora cellstorlek. Cellerna i lymfocyter porten sedan ritade i ett dot plot av CD3/14/20 färgade celler mot CD56 färgade celler till grind på NK-celler och samtidigt utelämna monocyter (CD14), T-celler (CD3) och B-celler ( CD20). Den CD56 POS gated befolkningen sedan utvärderas CD107a. Den NK-celler utan mål grupp används för att ställa portarna för vad som anses CD107a negativ. 7. 51 Cr Släpp analys (se figur 4) Infekterade målceller är märkta med 125 MCCI 51 Cr (Perkin Elmer) i saline/10 6 celler för 2 timmar i totalt 500 MCL vid 37 ° C och 5% CO 2. Som positiv kontroll 10 6 K562 celler är märkta med 100 MCCI 51 Cr för 2 timmar i totalt 500 MCL vid 37 ° C och 5% CO 2. Den totala volymen tas upp till 500 MCL med RPMI-klar. Volymen av 51 Cr läggs till målceller beräknas här: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator) Medan målceller är märkning, är tidigare isolerade NK-celler bort från kulturen och räknas. Cellkulturer som innehåller NK-celler centrifugeras vid 300 x g under 10 minuter med bromsarna på. Pellets innehåller NK-celler är suspenderade i RPMI-komplett och delas upp i tre rör. Cellen densiteten justeras till 10 5 / ml i ett rör, 2.5×10 5 / ml i det andra röret och 5×10 5 / ml i den tredje röret. Märkta mål celler tas bort från inkubatorn och 4,5 mL RPMI-komplett läggs till varje rör. Rör sedan centrifugeras vid 300 x GF eller 10 minuter. Supernatanten hälls ut försiktigt för att inte störa pelleten i en behållare för radioaktivt flytande avfall. Steg 4 och 5 upprepas två gånger att ta bort alla icke absorberat 51 Cr. Supernatanterna från tredje tvättningen kan avyttras i en container för icke-radioaktivt flytande avfall. Märkta mål sedan suspenderade i RPMI-komplett till ett slutligt celltäthet av 10 5 / ml. 100 MCL av märkt mål alikvoteras i brunnar i en 96-V-botten brunnar för en sista cell antal 10 4 målceller / brunn. Tabell 1 är ett exempel på en typisk konfiguration för ett 51 Cr släpp analys. Varje grupp görs i tre exemplar. 1 2 <td> 3 4 5 6 7 8 9 En K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) B UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (1:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (2,5:1) UI E: T (5:1) UI E: T (5:1) UI E: T (5:1) C HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (2,5:1) HIV-1 infekterade E: T (2,5:1) HIV-1 infekterade E: T (2,5:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) HIV-1 infekterade E: T (1:1) D E F K562 spontan frigörelse K562 spontan frigörelse K562 spontan frigörelse UI spontan frigörelse UI spontan frigörelse UI spontan frigörelse HIV-1 infekterade spontan frigörelse HIV-1 infekterade spontan frigörelse HIV-1 infekterade spontan frigörelse G K562 Högsta Släpp K562 Högsta Släpp K562 Högsta Släpp UI Högsta Släpp UI Högsta Släpp UI Högsta Släpp HIV-1 infekterade Maxmum Släpp HIV-1 infekterade Maxmum Släpp HIV-1 infekterade Maxmum Släpp 100 MCL av ovanstående NK cellsuspensioner läggs till varje brunn som innehåller målceller. 100 MCL mål läggs till motsvarande brunnar där effektorceller celler frånvarande för de högsta och spontan frigörelse grupper. Den spontana släpper gruppen är inkuberas med ytterligare 100 MCL av RPMI-klar. Den 96-brunnar är centrifugeras vid 20 x g 2 minuter med broms på. Den centrifugeras plattan är sedan inkuberas vid 37 ° C och 5% CO 2 i 4 timmar. Efter 4-timmars inkubation 5 MCL av en 1:10 spädning av mänskliga röda blodkroppar i RPMI-komplett tillsätts till varje brunn förutom det maximala släpper brunnar. 100 MCL 10% natriumdodecylsulfat läggs till det maximala släpper brunnar. Plattan är centrifugeras vid 400 x g i 5 minuter till pellets cellerna. 100 MCL av cell-fria supernatanten skördas från varje brunn och placeras i separata gamma-rör (Perkin Elmer). Rören placeras i en 2470 Automatisk Gamma Counter (Perkin Elmer). Mängden 51 Cr som finns i kulturen vätskan mäts som räknas per minut från genomsnittet av en 2-minuters läsning. Räknar per minut (CPM) avläsningar av proverna och kontrollerna används för att beräkna% specifika lysering med hjälp av följande ekvation: [(Experimentell CPM – medelvärdet av spontana CPM) / (medelvärde högsta CPM – innebär spontana CPM)] x 100 8. Representativa resultat: Figur 1. Stegen i isoleringen av naturliga mördarceller och generering av HIV-1 infekterade målceller från perifert blod. Figur 2. Stegen i byggandet av en CD107a degranulering analys utnyttja NK-celler som effektenheter och K562 celler, oinfekterade CD4 + T-celler och HIV-1 infekterade T-celler som mål. Figur 3. Flödescytometri-gating strategi för en CD107a degranulering analys. (A) gating på enskilda celler och exklusive klumpar eller dubletter på en tomt av FSC-A (Forward Scatter område) vs FSC-H (Forward Scatter höjd). (B) Enkel cell grind ritas som FSC-A mot SSC (Side Scatter) gating på lymfocyter befolkningen. (C) Lymphocyte grind ritas som CD3/14/20(T-celler, monocyter, B-celler) jämfört med CD56 (NK-celler) gating på CD56 POS andCD3/14/20 neg befolkning (NK gate). (D) NK grind ritas som CD107a vs CD56 för att visualisera NK-celler som har degranulated (CD107a POS). Figur 4. Stegen i byggandet av ett 51 Cr släppa analys utnyttja NK-celler som effektenheter och K562 celler, oinfekterade CD4 + T-celler och HIV-1 infekterade T-celler som mål. Figur 5. Representativa resultat för att bedöma cytotoxiska svar naturliga mördarceller mot HIV-1-infekterade celler. (A) NK-celler utvärderades för sin förmåga att degranulate utan mål och som svar på K562 element, CD4 + T-celler och HIV-infekterade primära T-celler enligt bedömning av den andel av NK-celler som uttrycker ytan CD107a. Siffrorna i varje kvadrant representerar andel av de totala NK-celler. B) NK-celler bedöms för sin förmåga att Lyse K562 celler, oinfekterade CD4 + T-celler och HIV-1 infekterade T-celler i ett 51 Cr släppa test på olika effektorcellpopulationerna till målcellen nyckeltal (E: T).