腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療薬として期待されています。治療前に患者から得られた生体組織標本の感染力を把握する能力は、この治療的アプローチのユニークな利点です。このプロトコルは、のための組織を処理する方法について説明します。<em>生体外で</em腫瘍溶解性ウイルスと、その後のウイルスの定量化と>感染症。
腫瘍溶解性ウイルスは、(OVS)を選択的に複製し、腫瘍細胞1を殺す新規な治療です。がんの治療薬としてHSV、レオウイルス、ワクシニアOVSを含む腫瘍溶解性、さまざまなプラットフォームの有効性を評価するいくつかの臨床試験は現在進行中2月5日です。腫瘍溶解性ウイルスの一つの重要な特徴は、それらが遺伝的に顕微鏡やバイオルミネッセンスイメージング6,7によって組織の感染を可視化することを可能にするレポーターの導入遺伝子を発現するように変更できるということです。それが成功した腫瘍溶解性ウイルス療法8の可能性を確認するために治療前に患者のex vivoでの組織を感染させる可能性があるので、これはユニークな利点を提供しています。そのためには、適切に組織の不均一性を補正し、感染9〜特に前の組織の生存率を、評価する組織をサンプリングすることが重要です。腫瘍溶解性プラットフォームでだけでなく、失敗に終わったと生産性の高い感染症を区別するために、均質化後の組織の直接滴定により表される場合には、報告の導入遺伝子を用いてウイルス複製をフォローすることも重要です。このプロトコルの目的は、これらの問題に対処するためであり、ここで1を説明します。細胞培養2の腫瘍組織の採取と準備。 GFPまたはホタルルシフェラーゼ4のいずれかを発現しているワクシニアウイルスと培養組織の代謝色素アラマーブルー(3)ex vivoでの感染を使用して組織の実行可能性の評価。蛍光顕微鏡またはin vivoイメージングシステム(IVIS)5 で使用して、導入遺伝子発現の検出。プラークアッセイによるウイルスの定量化。この包括的な方法は、組織の処理の容易さ、組織の不均一性の補正、組織の生存率の制御、および不稔感染や骨善意ウイルス複製の間に差別を含む、いくつかの利点があります。
このプロトコルの重要なステップの1つは、新鮮な組織サンプルを得ることである。サンプルが不適切なメディア(例えばPBS)で、手術室での長い待ち時間は、次の細胞培養に配置されている場合、これは組織の存続を危うくし、感染力を防ぐことができます。注目すべきは、正常組織は本質的に腫瘍組織に比べて、これらの影響を受けやすいです。もう一つの重要なポイントは、組織とそのサイズの一貫性をサンプリングするために使用するコア数です。このような組織の低酸素状態とinfectectable面などの要因は、コアとコアの四半期のサイズに応じて変動しますので、サイズの不一致は、患者サンプル間のばらつきにつながる。このは部分的に組織スライサーを使用して解決することができますが、ここで説明した方法の一つの利点は簡単にamenableはないソフトや粘性組織を含めて、、それは比較的容易であることが汚染を受けにくい、と組織の種類の多様に広く適用可能であるスライス組織へ。特に、コアの数は、よりよい組織の表現を得るために増加することができます。また、コアはそのようなDNA、RNA、またはタンパク質の抽出と並行して行われるため、他の潜在的なアッセイに対応するために、より多くの部分(例えば5-8)に切断することができる。しかし、コアが再現可能なサイズにカットすることができる作品の数は、異なるサイズのcorersを使用して変更することができるコア、の実際のサイズに依存します。オプションで、再現可能なサイズの組織片を得るのに役立つ一つの方法は、より小さな部分にそれらを細分化促進するために前に定規を使用してコアの長さを均等にすることです。プロトコルは、自然に他のウイルスに対応するように変更することができると我々は、組織が実行可能になると、最大6日間レプリケーションをサポートできることを見出した。プロトコルは、さらにcytrokinesを含む他のウイルス発現導入遺伝子の測定に拡張することができます。以下の感染は、組織をさらに組織の組織学のさらなる改良を可能にし、それがどのようにウイルス感染10月12日に関連する免疫組織化学的方法により切片と染色用パラフィンに埋め込 むことができます。
The authors have nothing to disclose.
我々は図2に示されたデータのために人間の手術標本を提供するための博士Hesham Abdelbaryに感謝したいと思います。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
Amphothericin B solution | Sigma Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
Pennicilin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Use at 1% |
Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
MEM powder | Gibco | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
Coomassie Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B7920 | |
2 mm Biopsy punch | Miltex | MX-33-31 | |
Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
Fluorescence disection Microscope | Leica | model M205 FA | |
In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
Tissue Tearor | Biospec products | model 985370-395 |