Oncolytic virus är lovande för cancerbehandling. Förmågan att ta reda på infectability av levande vävnadsprover från patienter före behandling är en unik fördel med denna terapeutiska strategi. Detta protokoll beskriver hur att behandla vävnad för<em> Ex vivo</em> Infektion med oncolytic virus och efterföljande virus kvantifiering.
Oncolytic virus (OVS) är nya behandlingar som selektivt replikera i och döda tumörceller 1. Flera kliniska studier som utvärderar effekten av olika oncolytic plattformar, inklusive HSV, Reovirus och Vaccinia OVS som behandling för cancer pågår 2-5. En viktig egenskap hos oncolytic virus är att de genetiskt kan modifieras för att uttrycka reporter transgener som gör det möjligt att visualisera infektion i vävnader genom mikroskopi eller bio-luminiscens bildbehandling 6,7. Detta ger en unik fördel eftersom det är möjligt att infektera vävnad från patienter ex vivo före behandling för att fastställa sannolikheten för en framgångsrik oncolytic virotherapy 8. I detta syfte är det viktigt att på lämpligt vävnadsprover för att kompensera för mjukpapper heterogenitet och bedömer vävnaden livskraft, särskilt före infektionen 9. Det är också viktigt att följa virusreplikationen med reportern transgener om det uttrycks av oncolytic plattformen samt genom direkt titrering av vävnader efter homogenisering för att diskriminera mellan misslyckade och produktiv infektion. Syftet med detta protokoll är att ta upp dessa frågor och här beskriver 1. Provtagning och beredning av tumörvävnad för cellodling 2. Bedömningen av vävnad livskraft använda metabola färgämnet Alamar blå 3. Ex vivo-infektion av odlade vävnader med vaccinia virus antingen uttrycker GFP eller eldfluga luciferas 4. Upptäckt av transgens uttryck genom fluorescensmikroskopi eller med hjälp av ett in vivo-Imaging System (IVIS) 5. Kvantifiering av virus av plack-analysen. Denna omfattande metod innebär flera fördelar, inklusive enkel vävnad bearbetning, ersättning för vävnad heterogenitet, kontroll av vävnad livskraft, och diskriminering mellan misslyckade infektion och ben fide virusreplikation.
En av de kritiska stegen i det här protokollet är att få färsk vävnadsprov. Om provet tas i cellodling efter en lång väntan på operationssalen på ett olämpligt material (t.ex. PBS), kan denna kompromiss vävnad livskraft och förhindra infectability. Att notera är normal vävnad sig mer benägna att dessa effekter än tumörceller. En annan kritisk punkt är hur många kärnor används för att provsmaka vävnad och konsekvensen i deras storlek. Inkonsekvenser i storlek kommer att leda till variationer i patientprover eftersom faktorer som hypoxi och infectectable ytan kommer att variera beroende på storleken av kärnor och kvartalen kärna. Även om detta kan delvis lösas med hjälp av vävnad skärmaskiner, är en fördel med metoden som presenteras här att det är relativt lätt, mindre benägna att föroreningar och allmänt tillämpas på en mängd olika vävnadstyper, inklusive mjuka eller trögflytande vävnader som inte lätta till vävnad skivning. Framför allt kan antalet kärnor höjas för att få bättre vävnad representation. Dessutom kan kärnor skäras i fler bitar (t.ex. 5-8) för att rymma andra potentiella analyser göras parallellt, såsom DNA, RNA eller protein extraktion. Däremot kommer antalet bitar där kärnorna kan kapas till reproducerbara storlekar beroende på den faktiska storleken på kärnor, som kan ändras med hjälp av olika storlek corers. Alternativt, är ett sätt att hjälpa få reproducerbart stora vävnad bitar för att jämna ut längden på kärnor med hjälp av en linjal före ytterligare dela upp dem i mindre bitar. Protokollet kan naturligtvis ändras för att rymma andra virus och vi har funnit att vävnader kan vara livskraftig och stöd replikering för upp till 6 dagar. Protokollet kan utökas till mätningar av andra viralt-uttryckta transgener inklusive cytrokines. Efter infektion, kan vävnaderna också vara inbäddade i paraffin för vidare snittning och färgning av immunhistokemiska metoder som möjliggör en ökad förädling av vävnaden histologi och hur det förhåller sig på virusinfektion 10-12.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Hesham Abdelbary för att ge människor kirurgiska preparat för de data som presenteras i figur 2.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
High glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
Fetal Bovine Serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
Amphothericin B solution | Sigma Aldrich | A2942 | Use at 0.1% |
Pennicilin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Use at 1% |
Alamar Blue | Invitrogen | DAL1025 | |
D-Luciferin potassium salt | Molecular Imaging Products | D-Luciferin potassium salt 1g | Resuspend in PBS at 10 mg/ml and filter on 0.22 μm filter |
MEM powder | Gibco | #41500018 | Make in half the suggested volume to make 2X MEM and filter on 0.22 μm filter prior to use |
Carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma Aldrich | C9481 | Make a 3% solution in deionized water and autoclave. Note that powder can take some time to resuspend |
Coomassie Brilliant Blue R | Sigma Aldrich | B7920 | |
2 mm Biopsy punch | Miltex | MX-33-31 | |
Double Edge Prep Blades | Personna Medical Care | 74-0002 | |
Fluorescence disection Microscope | Leica | model M205 FA | |
In vivo imaging system (IVIS) | Caliper Life Sciences | IVIS® 200 series | |
Tissue Tearor | Biospec products | model 985370-395 |