الجينوم شاشات التنافسية للمكتبات الخميرة Barcoded

Summary

قمنا بتطوير شامل وغير متحيز الجينوم واسعة لفهم الجينات شاشات المخدرات وتفاعلات الجينات والبيئة. وتعرض وسائل للكشف عن هذه المجموعات متحولة.

Abstract

بفضل التقدم في تقنيات الجيل القادم التسلسل ، علينا الوصول إلى تسلسل الجينوم جديدة يوميا تقريبا. وتيرة هذا التقدم يتسارع ، واعدا بمزيد من العمق والاتساع. في ضوء هذه التطورات غير العادية ، والحاجة إلى أساليب وسريع مواز لتحديد وظيفة الجين يصبح أكثر أهمية من أي وقت مضى. مجموعة من المسوخ الحذف الجينوم واسعة في الخمائر وهاء. القولونية كانت بمثابة حقوله المنتجة لتوصيف وظيفي لوظيفة الجينات ، ولكن هذا النهج ليس للتحجيم ، حذف الحالي الجينات النهج يتطلب كل واحد من آلاف الجينات التي تشكل الجينوم المراد حذفه والتحقق منها. يمكن فقط بعد اكتمال هذا العمل نسعى عالية الإنتاجية phenotyping. على مدى العقد الماضي ، وحسنت مختبرنا مجموعة من المنافسة ، المنمنمة الجينوم على نطاق عالية الإنتاجية ، المقايسات التي يمكن القيام بها بشكل متواز. هذه الموازاة ممكن لأن لإدراج 'علامات' الحمض النووي ، أو "الباركود" في كل متحولة ، مع الباركود بمثابة وكيل لطفرة واحدة ويمكن قياس وفرة الباركود لتقييم اللياقة البدنية متحولة. في هذه الدراسة ، ونحن نسعى لملء الفجوة بين تسلسل الحمض النووي ومجموعات متحولة barcoded. لإنجاز هذا نقدم مجتمعة ينقول تعطل – المتوازية النهج الذي يفتح المقايسات الباركود موازية لمتسلسلة حديثا ، ولكن تتميز سيئة الميكروبات. لتوضيح هذا النهج الذي يقدم مجموعة جديدة المبيضات البيض تعطل barcoded وتصف كيف يمكن استخدام كلا ميكروأري القاعدة والجيل القادم التسلسل المنصات المرتكزة إلى جمع 10000 — 1000000 الجينات الوراثية والجينات المخدرات التفاعلات في تجربة واحدة.

Protocol

1. معلومات أساسية هناك عدة طرق لتوليد المسوخ التي تحمل علامات الباركود. معيار الذهب الحالي هو الخميرة خروج المغلوب (YKO) جمع إنشاؤه من قبل مجموعة من المعامل والانتهاء منها في 2002 1. منذ أن قدم YKO الأصلي ، وقد تم إنشاؤها الخميرة مجموعات أخرى ، وفي الخلفيات سلالة مختلفة ، وذلك باستخدام أكثر من التعبير عن ثوابت ، والميكروبات الأخرى مثل E. 2 القولونية. في موازاة ذلك ، الجهود الرامية إلى إنشاء مكتبات barcoded shRNA يسير بسرعة ، في واقع الأمر ، وقد اعتمدت العديد من مبادئ التصميم لهذه المجموعات من الثدييات الخميرة. لشرح كيفية ترانسبوزونات barcoded يمكن أن تكون سريعة ، واستراتيجية للتطبيق على نطاق واسع لخلق مجموعات متحولة منهجي ، ونحن نركز على مجموعة واحدة أنشأنا مؤخرا في العوامل المسببة للأمراض الفطرية في الإنسان ، والمبيضات البيض. ويستند عملنا على المبيضات على نجاح شاشات الباركود في S. يستخدم خميرة ، وهنا بوصفه الكائن المثال. بروتوكول عينة ، ويمكن أن تستخدم مع تعديلات طفيفة على شاشة لأي كائن التي يمكن زراعتها في الثقافة تعليق. لأن القليل من الكائنات الحية معدلات عالية من التحول المطلوبة والكفاءة اللازمة لإعادة التركيب الإنقسامية إنشاء المسوخ الحذف الكمال ، وضعت وفقا لذلك لدينا بروتوكول يستخدم ينقول الطفرات في المختبر لmutagenize مكتبة الحمض النووي الجيني ، وحولت هذه الشظايا ثم الجينومية barcoded في المبيضات البيض 3 (4). مستوحاة من نجاح جمع YKO الأصلية ودورها في اكتشافات جوهرية على طبيعة الشبكات الجين 5-8 ، الجينوم على نطاق haploinsufficiency 9 ، الهدف المخدرات وآلية عمل 10،11 ، والإستخدامات الأساسية لجميع الجينات في جينوم 12 سوف نتوقع توسيع هذا النهج لميكروبات أخرى تكون مثمرة للغاية. بروتوكول أدناه يفترض أنه تم إنشاء مجموعة المرجوة متحولة (مثل المبيضات YKO أو جمع اضطراب albicans) ، وهو متاح في سلالات أرشفتها بشكل فردي. للحصول على وصف مفصل لبناء سلالة انظر 1،13،14. 2. الجمع بين المسوخ الفردية في مجموعة واحدة أسبوع واحد يسمح لتوليد مجمعة aliquots الخلية (يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في -80 درجة مئوية). تحسن أسهم الجلسرين المجمدة لسلالات من الفائدة تماما ولكن لا تدع لإذابة الخلايا تبقى> 2hrs. تعقيم أداة دبوس 96 – جيدا ، وتراجع أداة دبوس في الماء لإزالة أي الخلايا المتبقية ، تليها 2 الانخفاضات في الحمامات الايثانول 70 ٪ (على سبيل المثال مربع طرف الجفن ماصة) ، الشعلة أداة دبوس وبارد لمدة 1 دقيقة. الحرص على الشعلة أداة دبوس بعيدا عن الحمامات الايثانول. ينبغي أن يكون مستوى الحمامات الايثانول يتجاوز مستوى الماء في حوض الاستحمام لضمان ملتهب جميع المرحل الخلايا وإزالتها. استبدال الماء كل pinnings 4-6. إدراج أداة دبوس معقم 96 – جيدا في إذابة 96 – دوامة جيدا ، لوحة بلطف ونقل الخلايا إلى علبة تحتوي على أومني نونك YPD أجار بما في ذلك المضادات الحيوية المناسبة. تنمو المستعمرات حتى تصل إلى الحجم الأقصى عند 30 درجة مئوية (2 – 3D). للحفاظ على لوحات ، نجد أنها مفيدة للغاية لتعزيز four جيدا على 96 لوحات صينية ، أومني واحد مع سلالات 384 ~. بعد المستعمرات قد نمت ، لاحظ أي سلالات مفقود أو بطيئة النمو ، وهذه في ريبين ~ 2X كتلة الخلية مثل باقي السلالات. العمل في بيئة الأحياء الدقيقة (مع الشعلة ، والمختبرات الطبية المعقمة ، لوحة الفيضانات مع وسائل الاعلام مل 5-10 ، ينقع لمدة 5 دقائق والمستعمرات resuspend مع مفرشة الخلية. صب السائل بالإضافة إلى خلايا في أنبوب الطرد المركزي مخروطية 50 مل ، وإضافة إلى الجلسرين 15 ٪ أو DMSO إلى 7 ٪ (المجلد / المجلد). قياس OD 600 من حوض السباحة وضبط (عن طريق تخفيف أو الطرد المركزي) إلى التركيز النهائي من 50 OD مل / 600 مع وسائل الإعلام التي تحتوي على 15 ٪ أو الجلسرين DMSO 7 ٪. قسامة في 40 مجلدات ميكرولتر في أنابيب الشريط PCR والتجميد في -80 درجة مئوية. 3. تجريبية تجمع النمو ويرد هذا الاجراء في الشكل 1. aliquots تجمع ذوبان الجليد (في أنابيب PCR) على الجليد. إذا لم تكن تستخدم الروبوتات ، انتقل إلى الخطوة 5. مخفف على الفور (برفق!) تجمع في وسائل الاعلام مع المخدرات أو شرط الاختيار ، بتلقيح في جامعة النجاح OD 600 من 0.0625 في الحجم الإجمالي من 700 ميكرولتر في صفيحة ال 48 أيضا. وتشمل واحد على الأقل السيطرة المذيبات المناسبة على طبق من ذهب. عن التجارب التي تتجاوز 5 أجيال من النمو (أي أكثر من 1 أيضا) ، وملء الآبار المجاورة مع وسائل الاعلام او شرط من خيار ، ولكن الخلايا NO. ختم بختم طبق من البلاستيك ، وإذا كان الشرط يتطلب النمو الهوائية (على سبيل المثال ، ومصادر الكربون غير قابل للتخمر) ، استخدم إبرة قياس 21 إلى ثقوب في غشاء ختم نحو الجانب من كل جانب بيرس. تنمو في معمل ، والهز على 30 درجة مئوية مع محددات تجريبيا anنيد تهز النظام (على سبيل المثال 14 دقيقة هزة في أعلى الإعداد (أو التحكم في درجة حرارته شاكر) ، وقراءة الآبار ، واستئناف الهز). يمكن حصاده جزء من تعليق خلية الروبوت وحفظها على طبق بارد على سطح الروبوتية في المعرفة النقاط الزمنية جيل ، عادة 5 و 10 و 15 و 20 أجيال من النمو. (http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html ، للحصول على تفاصيل الاتصال أو جيم Nislow Giaever غ). دليل لنمو الخلايا ، تطعيم ثقافة مل 50 في التطوير التنظيمي بدءا 600 من 0،002 في قارورة 250 مل الثقافة. هزة في 30 درجة مئوية في 250 دورة في الدقيقة حتى تصل إلى خلايا OD النهائية 600 من 2.0 (لالسكيراء أو المبيضات) للأجيال 10 ~ للنمو. ويمكن الحصول على الأجيال إضافية من النمو من خلال تمييع الخلايا في جامعة النجاح OD600 من 2.0 إلى 0.02 مرة في قارورة جديدة. الحصاد على الأقل ~ 2 OD 600 وحدة من الخلايا لكل عينة / الساعة نقطة في أنابيب microcentrifuge الآمن للقفل. ملاحظة : دائما جمع عينة خلية البداية (أي "نقطة T0 الوقت") لتقييم أولي تمثيل السلالة في أي تجمع أنشئت حديثا وذلك بإضافة 1-2 OD 600 من تجمع مباشرة من الثلاجة لaliquots أنبوب 1.5 مل وتجهيزها كما هو موضح أدناه. 4. الجينومية استخراج الحمض النووي ، وتهجين ميكروأري PCR أو التسلسل تنقية الحمض النووي الجيني من ~ 2 OD 600 من الخلايا التي تحتوي على عدة الإنزيم YeaStar البحوث وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (البروتوكول الأول في حالة استخدام الحمض النووي الخميرة) ، أو طريقة أخرى مناسبة محددة لكائن من الفائدة (معيار الاستخراج الفينول / كلوروفورم تليها هطول الأمطار الكحول يعمل جيدا لالميكروبات المختلفة). إذا كان استخدام عدة YeaStar ، أزل الحمض النووي مع 300 ميكرولتر من TE 0.1X بدلا من 60 من ميكرولتر TE 1X المحددة في البروتوكول. ويمكن تخزين الحمض النووي إلى أجل غير مسمى في الجينومية -80 درجة مئوية. إنشاء شركتين تفاعلات PCR لكل عينة واحدة لuptags واحد للdowntags ، مع ظروف التفاعل على النحو التالي : 33 ميكرولتر DDH 2 O ، 6 ميكرولتر العازلة 10X PCR بدون MgCl 2 ، 3 ميكرولتر MgCl 50 مم 2 ، 1.2 ميكرولتر 10 dNTPs مم ، 1.2 ميكرولتر 50 ميكرومتر لأعلى أو لأسفل مزيج التمهيدي ، و 0.6 ميكرولتر 5 U / بوليميريز طق ميكرولتر ، ~ 0.1 ميكروغرام الحمض النووي الجيني في 15 ميكرولتر. الحجم الكلي هو 60 ميكرولتر. Thermocycle وفقا للشروط التالية : 94 درجة مئوية 3 دقائق و 30 دورات من 94 درجة مئوية 30S ، 55 درجة مئوية 30S ، و 72 درجة مئوية 30S ، ثم 72 درجة مئوية 3min ، وعقد في 4 درجات مئوية. فحص PCR المنتجات الناجمة عن مادة هلامية ، ومن المتوقع منتج غليان 60 لكل من تقارير إتمام المشروعات لamplicons المستخدمة في التهجين و130bp لamplicons لتسلسل الباركود). ويمكن عندئذ للمنتجات PCR يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. Prewarm التهجين الفرن على درجة الحرارة إلى 42 درجة مئوية ، وانشاء حمام ماء يغلي ودلو الثلج التي تحتوي على الطين جليد الماء. قبل الرطب صفائف عن طريق ملء ببطء مع 120 ميكرولتر العازلة التهجين 1X. في احتضان العازلة التهجين في 42 درجة مئوية و 20 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة. إعداد 90 ميكرولتر مزيج من التهجين لكل عينة ، زائد واحد خارج كمنطقة عازلة ، على النحو التالي : 75 ميكرولتر العازلة التهجين 2X ، 0.5 ميكرولتر قليل النوكليوتيد السيطرة B213 (0.2 FM / ميكرولتر) ، 12 [أليغنوكليوتيد] مختلطة ميكرولتر (12:05 / ميكرولتر) ، 3 ميكروليتر 50X دينهارت محلول) في تأمين قمة أنابيب مل 0.5. إضافة 30 ميكرولتر uptag PCR PCR و 30 ميكرولتر downtag إلى 120 ميكروليتر مزيج التهجين لوحدة تخزين ما مجموعه 150 ميكرولتر. يغلي لمدة 2 دقيقة وتدور أحداثه في المياه الجليدية للا يقل عن 2 دقيقة. باختصار تدور الأنابيب قبل الاستخدام. إزالة المنطقة العازلة قبل التهجين من المصفوفات وإضافة 90 التهجين ميكرولتر / مزيج PCR. لمنع التبخر ، وتغطي مجموعة جوانات مع بقعة صعبة. هجن لمدة 16 ساعة على 42 درجة مئوية ، و 20 دورة في الدقيقة. طازجة إعداد 600 التوسيم البيوتين ميكروليتر مزيج لكل عينة زائد واحد إضافي ، على النحو التالي : 180 ميكرولتر 20X SSPE ، 12 ميكرولتر 50X دينهارت و6 ميكرولتر 1 ٪ توين 20 (المجلد / المجلد) ، 1 ميكرولتر 1 ملغ / مل streptavidin – فيكوإيريترين ، 401 ميكرولتر DDH 2 O. تخزين جميع العينات streptavidin – PE في الظلام. قسامة 600 ميكرولتر في أنابيب 2 مل. إزالة البقع صارم من رقائق البطاطس. إزالة ببطء مزيج من التهجين صفائف بواسطة ماصة وملء ميكروأرس مع 120 ألف ميكرولتر اغسل رئيس محطة fluidics Affymetrix. غسل صفائف باستخدام fluidics Affymetrix المحطة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، وذلك باستخدام "الجينات Flex_Sv3_450" بروتوكول مع التعديلات التالية : 1 خطوة اضافية مع اغسل A (1 دورة (2) ، يمزج) قبل التلوين ، اغسل باء درجة الحرارة 42 درجة مئوية بدلا من 40 درجة مئوية ، وصمة عار في 42 درجة مئوية بدلا من 25 درجة مئوية. ومن الممكن أيضا لأداء غسل التهجين آخر ، وتلطيخ البيوتين ، وتغسل يدويا تلطيخ آخر (انظر ص 396 في مرجع 15). في أعقاب العمليات fluidics ، تشغيل محطة fluidics "SHUTDOWN_450" البروتوكول. بعد الغسيل ، وضمان عدم وجود فقاعات هواء موجودة. إذا لزم الأمر إضافة 90 ألف واغسل ميكرولتر ماصة ببطء حتى تختفي فقاعات. إذا كانت هناك أية علامات أو SMudges على سطح مصفوفة ، تنظيف زجاج النافذة مع الأيزوبروبانول ومنديل خالية من الوبر. تطبيق صارم اماكن جديدة على حشيات / حواجز ووضع صفائف في الماسح الضوئي. المسح في الماسح GeneArray Affymetrix في الطول الموجي لانبعاثات من 560 نانومتر. 5. تحليل مجموعة (انظر الشكل 2 للحصول على مثال تم الحصول عليها باستخدام تعطل جمع المبيضات البيض) اخفاء ناشز : لأن مجموعة TAG4 Affymetrix يحتوي على 5 يعيد كل تكمل الباركود فرقت عشوائيا أي مسبار الباركود أن ينحرف عن يتطابق يمكن ملثمين والتخلص منها. للقيام بذلك ، لكل ميزة الصفيف التي يبدو أن قيمة عزلاء استنادا اشارة بالمقارنة مع غيرها من 4 يعيد هذه الميزة ، لدينا برامج يدرس لأول مرة 5 الميزات التي تحيط ناشز المتهم ، وإنتاج مصفوفة من 25 الميزات مع المشتبه به الميزة في المركز. إذا> 13/25 تحقيقات في هذه المنطقة تختلف عن بعضها من الفردية التي تعني تكرار قلص (الوسط من ثلاثة منتصف يتطابق ، مع استبعاد أعلى وأدنى مكررات) من قبل أكثر من 10 ٪ ، ثم يتم تجاهل هذا المسبار من مزيد من التحليل. لأن مثل هذه القيم المتطرفة هي في معظم الأحيان نتيجة لعدم تناسق الغسيل بعد التهجين ، ونحن توسيع أو "سادة" في المنطقة التي تحتوي على تحقيقات المشتبه فيه. تحقيقات وسادة من هذا القبيل بما في ذلك جميع تحقيقات داخل دائرة نصف قطرها 5 التحقيق ، كما تم تعريفها بواسطة ((س 1 س 2) 2 + (ص 1 ص 2) 2) ونصف <6 حيث x 1 ، س 2 ، ص 1 ، و ص 2 هي الإحداثيات x و y للميزات اثنين. أخيرا ، تجاهل الميزات التي الانحراف المعياري (المضمنة في الملف. سل للصفائف Affymetrix) بكسل ميزة / بكسل يعني الميزة. بعد إزالة القيم المتطرفة ، ومتوسط ​​كثافة القيم لجميع ما تبقى متماثلة. إزالة العلامات غير صالحة للاستخدام : الكلمات الدلالية مع القيم المنخفضة الحدة تعطي نتائج رديئة النوعية ، ويجب إزالتها. ويمكن حساب بقطع الاستبعاد لهذه التحقيقات كثافة منخفضة كما يلي : عن أي معاملة الزوج السيطرة على المصفوفات ، حساب سجل 2 ((ط ج ب ز) / (ط ر ب ز)) عن كل علامة ، حيث ط ج هو شدة الرقابة ، ط ر هو شدة المعاملة ، و ب ز هو يعني كثافة من تحقيقات العلامة المعينة. إقران uptag ونسب downtag عن سلالة لكل زوج والعلامة ، واتخاذ الحد الأدنى لكثافة العلامات اثنين في العينتين. فرز أزواج نسبة كثافة هذه الدنيا. استخدام حجم نافذة انزلاق 50 على أزواج المرتبة نسبة ، حساب ارتباط uptag وdowntag أزواج نسبة داخل الإطار. أيضا حساب متوسط ​​كثافة أدنى حساب في الخطوة السابقة. شريحة نافذة بنسبة 25 زوجا ، وكرر الخطوة السابقة حتى يتم تجاوز كل أزواج. رسم الحد الأدنى لمتوسط ​​كثافة مقابل ارتباط uptag – downtag لجميع النوافذ. أخيرا ، اختيار شدة العتبة ، عادة نستخدم قيمة كثافة حيث يصل أولا ارتباط 80 ٪ من مستواه الأقصى. العلم ومزيد من التحليل من إزالة أية علامات أقل من هذا الاعفاء. التشبع تصحيح : لأن كل ميزة على ميكروأري الباركود يمكن أن تصبح مشبعة ، ليست مؤشرا على مجموعة TAG4 المرتبطة خطيا إلى تركيز العلامة. لتصحيح هذا التشبع اتباع البروتوكول الموصوفة في المرجع 16. التطبيع الصفيف : بالنسبة لكل مجموعة ، وتطبيع uptags downtags بشكل منفصل. quantile لتطبيع ورتبته القيم التي تم الحصول عليها من كل مجموعة لuptags وdowntags من أجل زيادة كثافة. يعني تطبيع لكل مجموعة من uptags وdowntags ، القسمة الوسط. التطبيع يعني جميع المصفوفات التالية هي الخطوة الثانية تحويل البيانات الخام إلى الوسط من كل مجموعة. احتساب درجات الحساسية للسيطرة على العلاج المقارنات : سجل 2 لاستخدام النسب بوصفها متري من الحساسية : بالنسبة لكل سلالة ، وحساب سجل 2 ((μ ج ب ز) / (μ ر ب ز)) ، حيث c هو μ يعني كثافة لعينات السيطرة ، μ ر هو كثافة يعني لعينات العلاج ، وب ز هو يعني كثافة للتحقيقات غير معين. سلالات مع نسبة ايجابية 2 سجل حساسة للعلاج ، وتلك التي تقاوم السلبية وسجل 2 النسب. 6. تقييم اللياقة البدنية للسلالات الخميرة barcoded بواسطة التسلسل عزل الحمض النووي من برك الحذف كما هو موضح لميكروأرس. تضخيم كل الباركود uptag 20 ميه مع الاشعال مركب يتألف من سلاسل من الباركود الاشعال العامة وتسلسل المطلوبة لتهجين للflowcell البورشيد (انظر جدول الاشعال البورشيد والشكل 3 لرسم تخطيطي للamplicon). هؤلاءويمكن استخدام أجهزة الاشعال المحلاة دون تنقية إضافية. يتم تنفيذ PCR في 100μL ، وذلك باستخدام Invitrogen البلاتين PCR Supermix (الفئة رقم 11306-016) مع الشروط التالية : 95 درجة / 3 C دقيقة و 25 دورات من 94 ° C/30 ثانية ، 55 ° C/30 ثانية ، 68 ° C/30 ثانية ؛ يليها 68 ° C/10 دقيقة. تنقية المنتج PCR (~ 130bp) مع MinElute Qiagen 96 UF أدوات تنقية PCR (الفئة رقم 28051). بعد تنقية PCR ، تحديد الحمض النووي مع كوانت – IT Invitrogen dsDNA أدوات الفحص BR (القط رقم Q32853). لا تعتمد على قراءات 260/280! تطبيع تركيز الحمض النووي لأحجام متساوية 10μg/ml وبركة طبيعية من الحمض النووي. فصل الحمض النووي مجمعة على هلام بولي أكريلاميد TBE 12 ٪ عن 3-4 ساعات اعتمادا على الجهد المستخدمة. وصمة عار المواد الهلامية مع بروميد إيثيديوم (Sybr الخضراء ينبغي العمل كذلك) لمدة 30 دقيقة. موقع الفرقة الفائدة على الموجة الطويلة صندوق الضوء فوق البنفسجية (يرتدي الحماية الملائمة الوجه) ، وقطع بها واستخراج الحمض النووي باستخدام أسلوب سحق ونقع 17 تليها هطول الأمطار الايثانول. تؤكد أنه تم عزل الحمض النووي الحجم المناسب (130bp) والتي أزيلت الاشعال باستخدام Bioanalyzer اجيلنت عالية الحساسية DNA مجموعة (كات رقم 5067-4626). نموذج التسلسل : البورشيد GAIIx منصة : إنشاء مجموعات على flowcell واحدة للقراءة باستخدام الجيل الكتلة CBOT واحدة للقراءة كيت (القط رقم GD – 300 – 1001). لقراءة 1 ، ويتم تجميع UP – DOWN العلامة تعديل الاشعال التسلسل بتركيز 100uM الأسهم وإضافتها إلى أنبوب الشريط (0.6μL كل التمهيدي التسلسل 100uM في 120 ميكرولتر HT1). يستخدم SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 صفة لتوليد مجموعات R1. التسلسل على منظمة شات محلل الجينوم. الدورات التالية التسلسل 18 ، وتستخدم وحدة المقترنة نهاية لتجريد حبلا وتصنيعه لأول مرة في rehybridize flowcell ، وذلك باستخدام R1 البورشيد (أدناه). وتتم تعبئة التجمعات والتسلسل لمدة 5 دورات لالتقاط العلامة الفهرس. يتم استخدام تسلسل سمة فهرس بن متواليات في صناديق التجريبية. داخل كل بن التجريبية ، وأحصت تسلسل الباركود الخميرة لإعطاء العدد الإجمالي للتهم لكل الباركود. العد حتى يتم تطبيع quantile كل تجربة وتوزيع العد نفسه. قياسا على التجارب الباركود ميكروأري اللياقة البدنية ، ونسب العيب اللياقة البدنية لكل سلالة وتحسب كما وأعرب عن نسبة 2 سجل (التحكم / العلاج). عيب اللياقة البدنية الإيجابية عشرات دلالة على انخفاض في وفرة سلالة خلال العلاج من تعاطي المخدرات واقتراح ما هو مطلوب الإصدار البرية نوع الجينات في حذف تلك السلالة التي لمقاومة المخدرات أو مثبط. ملاحظة : نظرا بار بعدها كبديل للتهجين الصفيف. مع تكاليف عالية الإنتاجية تسلسل تناقص ، وذلك باستخدام عالية الإنتاجية تسلسل بوصفها قراءات من وفرة البطاقات أصبحت مجدية في كثير من الحالات ، هو أكثر فعالية من حيث التكلفة 18. بهذه الطريقة ، يتم قياس تضخيم PCR المنتج مباشرة ب "تهمة" بدلا من أن كثافة إشارة والمهجنة لصفيف. هذا يلغي السلبيات والإيجابيات الكاذبة التي تنشأ عن البطاقات عبر التلوث ، والتشبع ، أو القضايا الناشئة عن كثافة إشارة عالية جدا أو منخفضة جدا. وعلاوة على ذلك ، يمكن الجمع بين عدة تجارب سابقة لتسلسل عن طريق إضافة الحمض النووي قاعدة 08/04 المؤشر 19. لأن الخميرة الباركود هي 20 سنة مضت ، واحد ، 2 – خطوة قراءة قواعد 26-28 يلتقط كل من مؤشر متعددة وفريدة من نوعها الباركود ، والسماح ل 100 + مضاعفة المدقع. في وقت كتابة هذا التقرير ، بار وما يليها ميزة التكلفة على شريط رمز ميكروأرس ، وعلاوة على ذلك ، بار وما يليها من هذا القبيل هو مرن بطبيعته أنه كلما ازداد عدد القراءات / تشغيل ، ومضاعفة مستوى يمكن أن تزيد من تكاليف مزيد من الانخفاض . وعدة "منتصف القدرات" التعاقب من جميع الشركات المصنعة للمنصة الرئيسية إضفاء مزيد من الديمقراطية بار وما يليها ، مع تسلسل المرجح أن تصبح قراءات في الاختيار. كما تم التحقق من هذا البروتوكول على HiSeq2000 البورشيد. ويقدم دليلا ممتازا للاستخدام تسلسل بار لمعالجة المسألة الأساسية البيولوجي في السيطرة على نمو خميرة السكيراء في دراسة حديثة أجرتها جريشام وآخرون (20). الذين مخطط تصميم عدة تجريبية مهمة والمبادئ التوجيهية التفسير. 7. تأكد من صحة البيانات المجمعة الفرز وينبغي التحقق من نتائج فحص أي الجينوميات الوظيفية باستخدام سلالات الفرد في ثقافة معزولة. لأن كل التجربة سوف تختلف من حيث عدد السلالات الحساسة ، واختيار عدد من السلالات المرشحة لتأكيد هو إجراء تعسفي إلى حد ما. كدليل ، لتحتل المرتبة السلالات الأكثر حساسية من نسبة 2 سجل ض أو درجة واختبار أعلى 25-50 ٪ من المرشحين (والذي يترجم عادة إلى دي القياسية 2-3viations يعني من جميع السلالات في التجمع) هو توازن جيد بين التكاليف والفوائد. لا يمكن أن يؤديها الفرد في أي تأكيدات القارورة لكننا تنفيذ هذه الاختبارات لمدة 5 أجيال من النمو بشكل جيد في 96 لوحات باستخدام اللقاح بدءا من 0.06 OD 600 في 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام في معمل الهز ، وأخذ قياسات كل 15 دقيقة (انظر الشكل 4) . 8. ممثل النتائج مرة واحدة على شاشة واسعة الجينوم كاملة ، ولقد تم تطبيع المصفوفات وسلوك كل سلالة بالمقارنة مع العلاج السيطرة (على سبيل المثال عن طريق مقارنة شدة ميكروأري أو التسلسل التهم / سلالة) هي الأكثر سهولة التلاعب بها البيانات في ملف Excel مع الجينات مرتبة حسب النسب log2 السيطرة / التجربة. بهذه الطريقة ، وزيادة نسبة log2 السلبية ، وأكثر حساسية لتلك السلالة على وجه الخصوص في حالة الاختبار. يمكن رسم هذه الملفات التفوق في مجموعة متنوعة من الرسوم البيانية حزم البرمجيات. نجد أنه من أبسط لرسم نسب log2 على المحور Y والجينات أو أسماء ORF على محور X. في المثال هو موضح في الشكل 2A ، يتم عرض هذه مؤامرة من العلاج كلوتريمازول (مضاد للفطريات وكيل المعروفة). ويسلط الضوء على كل سلالة حساسة إلى حد كبير في المعاملة مع نسبة log2 من 2 باللون الأحمر ، ونحن سوف تحقق العديد من سلالات عادة مثل هذه المقايسات في نمو الفرد من كل متحولة في وجود تركيز نفسها من المخدرات. في هذا المثال ، يتم تسليط الضوء 4 سلالات ، NCP1 ، ERG2 و 2 الأليلات ERG11 مستقلة ، والهدف من البروتين المعروف كلوتريمازول. وتشارك بشكل مباشر في كل من هذه الجينات في 4 إرغوستيرول الحيوي ، والخميرة ما يعادل نسبة الكوليسترول. على سبيل المثال ، NCP1 يشفر اختزال NADP – P450 السيتوكروم التي تشارك في إرغوستيرول الحيوي والذي يرتبط مع وينظم coordinately Erg11. هذا المثال الضوء على حقيقة أن يتم التعرف على الهدف المخدرات المعروفة (Erg11) في هذه الشاشة غير منحازة ، فضلا عن العديد من العناصر الأساسية الأخرى في مسار الهدف. أخيرا ، فإن العديد من الجينات التي أبرزت في الحمراء تمثل الجينات التي يمكن أن تشارك في إرغوستيرول الحيوي أو البيولوجي في عمليات منفصلة. كما ذكر أعلاه ، يجب التحقق من كل سلالة اكتشفت أنها حساسة في شاشة المجمعة لحساسيتها كما في مقايسة نمو الفرد. في المثال هو موضح في الشكل 2B ، وأكدت أربع سلالات لتكون حساسة لكلوتريمازول على أساس نموها انخفضت نسبة إلى سلالة الأم من النوع البري ، BWP17. هذه منحنيات نمو الفرد تسليط الضوء على سمة هامة من سمات هذه الشاشات الجينات المخدرات مجمعة ، وهذا هو في المرتبة المطلقة لسلالة معينة لا تعكس بالضرورة مستوى الدقيق للحساسية. علاوة على ذلك ، كما يبين الشكل 2B قيمة لها الأليلات متعددة لكل الجينات ، في هذه الحالة ، وهما المسوخ تعطل erg11 وتختلف قليلا الحساسيات. ويمكن الربط بين طبيعة هذه الاضطرابات مع درجة حساسية تقدم نظرة إضافية إلى آلية عمل الأدوية. الشكل 1. سير العمل لفحص الكشف عن النمو المجمعة والباركود. يتم تلقيح الثقافات مع aliquots إذابة الخلايا المجمعة (الخطوة 1) ، ونمت ثم الرقم المطلوب للأجيال (الخطوة 2) إما آليا (الخيار أ) أو يدويا (الخيار باء). ويتم حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي (الخطوة 3) ، ويتم عزل الحمض النووي الجيني ثم من الخلايا التي تحصد (الخطوة 4) ، وتتضخم بشكل مستقل وuptags downtags (الخطوة 5) ، وتهجين إلى صفيف (الخطوة خطوة 6A أو التسلسل مباشرة 6B). الشكل 2. نموذج بيانات تم جمعها في نقطة معينة من البروتوكول. (أ) بيانات نموذج من نتائج الفرز (مقتبس من 13). وقد نمت مجموعة من المسوخ المفتاحية لمدة 20 أجيال ، في حضور وكلوتريمازول DMSO (مراقبة). سجل نسبة 2 (مراقبة كثافة / العلاج كثافة) تم حسابها وتآمر بوصفها وظيفة من الجينات. وشملت سلالات حساسة للغاية (الحمراء) هدف معروف من كلوتريمازول ، ERG11p. علما بأن هذا الاختبار يكشف كثيرا المسوخ الحساسة الأخرى ، بالإضافة إلى استهداف المجمع الفعلي. عموما ، هذه المسوخ هي تلك التي تعمل صناعيا مع الهدف ، وتلك التي هي جزء من الاستجابة للضغط النفسي / العلاج العام ، أو هي ايجابيات كاذبة التي تفشل في تأكيد. (ب) مثال لتأكيد البيانات (مقتبس من 13). يمكن التحقق من صحة النتائج من المقايسات النمو المجمعة من خلال زراعة سلالة في الثقافة الفردية ومقارنتها من النوع البري النمو (السوداء). الشكل 3. هيكل amplicon المنتجة من المقايسات الباركود المجمعة للتهجين ميكروأري أو التسلسل الباركود. وينتج عن كل amplicon متحولة طن جمع يحتوي على التماثل للجينوم من أجل التكامل (مناطق الزرقاء والمسمى ATG TAA) ، الباركود فريد (المسمى AG ، وأشارت من قبل شرطة السوداء). لتهجين ميكروأري ، تستخدم أجهزة الاشعال الزرقاء شيوعا لتضخيم لتحقيق 60bp ميكروأري التهجين. لتسلسل الباركود ، وتستخدم أجهزة الاشعال الموسعة في تفاعل PCR ، التي تتألف من تسلسلات ترميز محول البورشيد (أحمر بار) ، وفهرس البوابات المتبادل 6bases) والتمهيدي الزرقاء مشتركة للالتمهيدي المنبع ، وناقص التمهيدي نفس المركب ( مؤشر قاعدة 6) لالتمهيدي الثاني. الشكل 4. النمو المقايسات الخاصة 1) الغربلة ضد المركبات البرية من نوع الخميرة من أجل تحديد الجرعة المناسبة للفحص واسعة والجينوم 2) تؤكد النتائج من على شاشات الجينوم واسعة. (A) هو ملأ 96 لوحة مسطحة القاع جيدا مع 100 ميكرولتر من التعليق الخلية في جامعة النجاح OD من 0.062. يمكن أن تحتوي على كل بئر نفس السلالة (لتحديد الجرعة) أو سلالة مختلفة والمخدرات تركيبات (لفحوصات تأكيد). يضاف 2 ميكرولتر من مركب (المنحلة عادة في DMSO) ، ونمت الخلايا مع الهز المستمر ل16-20 ساعة عند 30 درجة مئوية. وينبغي تركيز النهائي من DMSO لا تتجاوز 2 ٪. في هذا المثال ، في كل بئر من لوحة يتم رسم منحنى النمو في مؤامرة ضد السود من سيطرة منحنى النمو في الحمراء. (ب) من القرار صورة العالي prescreens عدة حصلت مع المخدرات المثال متراكبة فوق بعضها البعض. في هذه السلسلة المعايرة ، بعد الحصول على IC 10-15 مع جرعة الأرجواني وسيكون من المناسب لحذف التنميط (HIP HOP و). نظرا لعدم الخطي في أعلى كثافة ضوئية ، يجب معايرة Tecan (أو أي قارئ لوحة مشابهة) باستخدام المواد المستنفدة للأوزون تلك التي حصلت مع "التقليدي" كفيت طول مسار 1MM.

Discussion

هنا ، حددت لدينا بروتوكول ، مع التعديل متواضعة ، ويمكن بسهولة أن تتكيف مع مجموعة واسعة من مجموعات القائمة من مجموعات متحولة barcoded من الكائنات الحية الدقيقة المختلفة لإنشاء مجموعات متحولة المفتاحية. فإننا نؤكد أنه على الرغم من أننا قد أبلغت بروتوكولا حول الطفرات ينقول المفتاحية للالخميرة الممرضة C. يمكن albicans ، يمكن تكييفها على بروتوكول مشابهة جدا لمجموعة واسعة من الفطريات وحيدة الخلية. تعديل هذا البروتوكول يعمل بشكل جيد في البكتيريا ¹³ ، ومجموعات حاليا لعدد من العوامل الوراثية إضافية الفطرية والبكتيرية هي قيد الانشاء. في الوقت الحاضر ، يوفر هذا الاختبار الشامل فقط ، الجينوم على نطاق الشاشة غير منحازة للتفاعل الجينات جزيء صغير. ميزة واحدة مقنعة خاصة للمقايسة هو أن هناك حاجة إلى المعرفة المسبقة للجينات أو جزيء صغير. على الرغم من نطاق وقوة هذه المقايسات ، وعرقل نقلها إلى مختبرات أخرى إلى حد ما من الاستثمارات الرأسمالية الأولية والأدوات المعلوماتية لتحليل النتائج. مع اعتماد قراءة تسلسل الجيل المقبل جنبا إلى جنب مع أدوات قوية لتحليل ، فإننا نتوقع زيادة اعتمادها.

Materials

Antibiotics	Vendor and catalogue numbers
Carbenicillin	Sigma, part# C1613
Kanamycin	Sigma, part# K1876
spectinomycin	Sigma, part# S0692
Chloramphenicol	Sigma, part# C0378
DNA Clean-up and concentration kits
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen, part# 27106
HiSpeed Plasmid Maxi Kit	Qiagen, part# 12663
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen, part# 28106
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen, part# 28704
PCR and electrophoresis reagents
Taq DNA Polymerase (Mg-free) Buffer	New England Biolabs, part# M0320L
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs, part# N0447L
25 mM MgCl2	Sigma, part# 63036
Agarose, loading dye, and nucleic acid stain suitable for gel electrophoresis	Various
10X TAE buffer	Sigma, part# T8280
1 Kb Plus DNA Ladder	Invitrogen, part# 10787026
YPD broth
10 g of yeast extract	Sigma, part# Y1625
20 g Bacto peptone	BD Biosciences, part# 211677
20 g of dextrose	Sigma, part# D9434
Labware
Multichannel pipettes (1000, 200, and 20 μL)	Various
Disposable pipetting reservoirs	Various
15 and 50 mL centrifuge tubes	Various
96- and 384-Well Deep Well Plates	Axygen Scientific, part# P-2ML-SQ-C-S & P-384240SQCS
96-well and 384-well PCR plates and seal film	Various
Plate roller for sealing multi-well plates	Sigma, part# R1275
30°C and 37°C shaking incubators for growing bacterial and yeast on plates and in tubes	Various
In vitro transposon mutagenesis
EZ-Tn5 Transposase	Epicentre Biotechnologies, part# TNP92110
High-throughput transformation
Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit	Edge Biosystems, part# 84359
polyethylene glycol, molecular weight 3350	Various
lithium acetate	Sigma, part# 517992
6-well plates, sterile	Corning, part# 3335
50 mg/mL uridine	Sigma, part# U3750
100X Tris-EDTA buffer solution	Sigma, part# T9285
1X TE/0.1M LiOAc	Various
salmon testis DNA	Sigma, part# 1626
Growth of barcoded collections
48-well plates; if growing cultures in plates	Greiner, part# M9437
Adhesive plate seals	ABgene, part# AB-0580
200 mL culture flasks	Various
Spectrophotometer capable of absorbance	Various
Temperature-controlled shaker for 250 ml flasks or shaking spectrophotometer	Various
Safe-Lock Microcentrifuge Tube, 2 mL	Eppendorf, part# 0030 120.094
Hybridization equipment
Hybridization Oven 640	Affymetrix, part# 800138
GeneChip Fluidic Station 450	Affymetrix, part# 00-0079
GeneArray Scanner 3000	Affymetrix, part# 00-0212
Boiling water bath with floating rack	Various
Hybridization consumables
Genflex Tag 16K Array v2	Affymetrix, part# 511331
Denhardt’s Solution, 50X concentrate	Sigma, part# D2532
Streptavidin, R-phycoerythrin conjugate (SAPE)	Invitrogen, part# S866
Safe-Lock Microcentrifuge Tube, 0.5 mL	Eppendorf, part# 0030 123.301
Teeny Tough-Spots	Diversified Biotech, part# LTTM-1000
0.5 M EDTA	BioRad, part# 161-0729
10% Tween	Sigma, part# T2700
MES free acid monohydrate	Sigma, part# M5287
MES sodium salt	Sigma, part# M5057
5 M NaCl	Sigma, part# 71386
20X SSPE	Sigma, part# S2015
Molecular biology grade water	Sigma, part# W4502
Hybridization Primers	Various suppliers (standard desalting)
Uptag	5′ GATGTCCACGAGGTCTCT 3′
Buptagkanmx4	5′ biotin-GTCGACCTGCAGCGTACG 3′
Dntag	5′ CGGTGTCGGTCTCGTAG 3′
Bdntagkanmx4	5′ biotin-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3′
B213	5′ biotin-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3′
Uptagkanmx	5′ GTCGACCTGCAGCGTACG 3′
Dntagkanmx	5’GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3′
Uptagcomp	5’AGAGACCTCGTGGACATC 3′
Dntagcomp	5’CTACGAGACCGACACCG 3′
Upkancomp	5’CGTACGCTGCAGGTCGAC 3′
Dnkancomp	5’CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3′
Sequencing Primers: Illumina Platform	Various suppliers
UpTag Forward (100uM)	5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3′
UpTag Reverse (100uM)	5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3′
DownTag Forward (100uM)	5′ CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3′
DownTag Reverse (100uM)	5′ AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3`
Read 1 UP-tag seq primer (100uM)	5′ GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3′
Read 1 DOWN-tag seq primer (100uM)	5′ CGG TGT CGG TCT CGT AG 3′
Read 2 Index Sequencing primer (standard Illumina R1 primer) (100uM)	5′ AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3′
Additional Sequencing Reagents/Equipment
Qiagen MinElute 96 UF PCR purification Kit	Qiagen, part# 29051
Vaccum pump	Any vendor
Macherey-Nagel Vaccum Manifold	Macherey-Nagel, part# 740 681
Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen, part# Q32853
Invitrogen Qubit assay tubes	Invitrogen, part# Q32856
40% acrylamide plus 1% N,N’-methylene-bis-acrylamide, 37.5:1	Bio Rad, part# 161-0148
Tris Base	Sigma, part# T1503-1KG
Boric Acid	Sigma, part# B6768-500G
0.5M EDTA, pH 8.0	Teknova, part# E0306
Ammonium Persulfate	Sigma, part# A3678-25G
TEMED	Bioshop, part# TEM001.25
Ethidium Bromide Solution	Bioshop, part# ETB444.10
0.5M Ammonium acetate	Teknova, part# A2000
10mM Magnesium acetate tetrahydrate	Sigma, part# M0631-100G
1mM EDTA, pH 8.0	See 0.5M EDTA, pH 8.0
Ethanol	Various
Sodium acetate, pH 5.2	Teknova, part# S0297
Speed vacuum	Various
Single-Read Cluster Generation Kit	Illumina, part# GD-300-1001
36c Sequencing Kit v4	Illumina, part# FC-104-4002

10X TBE recipe

Amounts	Reagents
108 grams	Tris Base
55 grams	Boric Acid
40mL	0.5M EDTA (pH 8.0)
Add dH2O to 1L mark

12% Polyacrylamide gel recipe

Volumes	Reagents
5.8 ml	40% acrylamide plus 1% N,N’-methylene-bis-acrylamide, 37.5:1
12 ml	dH2O
2 ml	10X TBE
140 μl	10% Ammonium Persulfate
Total volume: 20ml

Uptag primer mix:

Resuspend Uptag and Buptagkanmx4 each in ddH₂O at 100 μM, then mix in a 1:1 ratio for a final concentration of 50 μM each. Store at -20°C.

Downtag primer mix:

Resuspend Dntag and Bdntagkanmx4 each in ddH₂O at 100 μM, then mix in a 1:1 ratio for a final concentration of 50 μM each. Store at -20°C.

Mixed oligonucleotides:

Resuspend each of the following eight oligos (standard desalted) in ddH₂O at 100 μM:
Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp.
Mix an equal volume of the eight oligonucleotides for a final concentration of 12.5 μM each.

12X MES stock:

For 10 ml, dissolve 0.7 g MES free acid monohydrate and 1.93 g MES sodium salt in 8 ml molecular biology grade water. After mixing well, check pH and adjust if needed to a pH 6.5-6.7. Add water to a total volume of 10 ml. Filter sterilize and store at 4°C protected from light (e.g., wrap the tube in foil). Replace if solution becomes visibly yellow or after 6 months.

2X Hybridization buffer:

For 50 ml, mix 8.3 ml of 12X MES stock (from 2.9.14), 17.7 ml of 5 M NaCl, 4.0 ml of 0.5 M EDTA, 0.1 ml of 10% Tween 20 (vol/vol), and 19.9 ml filtered ddH₂O. Filter sterilize.

Wash A: Mix 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol/vol), 699 ml ddH₂O. Filter sterilize.
Wash B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol/vol), 849 ml ddH₂O. Filter sterilize.

Barcode sequencing primers

In UP-tag primer sequences the 5′ tail (bold) are Illumina specific adaptor sequences incorporated into the F and R primer. The variable sequence (italics) represents the 5-mer indexing tag used in multiplexing/ index read-out. The 3′ tail (underlined) represents the common primer flanking the uptag barcode and is required to amplify the yeast barcodes.

In DOWN-tag primer sequences the 5′ tail is identical to 5′ tail of UP-tag primers (Illumina specific sequence), however, the 3′ tail (underlined) is replaced with the common primers that are used to amplify the DOWN-tag barcodes.