En gen överföringsmetod i utvecklingsländerna musen hjärnan beskrivs med hjälp av en unik kirurgisk metod och speciella form av elektroder. Denna unika teknik gör det möjligt transfektion av plasmid-DNA tidsmässigt och rumsligt, som kommer att hjälpa många neuroforskare för att studera hjärnans utveckling.
För att förstå funktionen hos gener som uttrycks i viss region i den växande hjärnan, inklusive signalmolekyler och axonet molekyler vägledning, lokala genöverföring eller knock-out krävs. Riktad genmodifiering knock-in eller knock-out i lokala regioner är möjligt att utföra med kombination med en specifik CRE linje, vilket är mödosamt, kostsamt och tidskrävande. Därför kommer en enkel transfektion metod, en i livmodern elektroporering teknik, som kan utföras med kort tid, vara praktiskt att testa möjliga funktion av gener innan generationen av transgena djur 1,2. Utöver detta, i livmodern elektroporering mål områden i hjärnan där ingen specifik CRE linje existerar, och kommer att begränsa embryonal dödlighet 3,4. Här presenterar vi en metod att i livmodern elektroporering kombinera två olika typer av elektroder för enkel och bekväm genöverföring till målområden i den växande hjärnan. Först kommer en unik innehav metod av embryon med hjälp av en optisk fiber ljus kabel gör små embryon (från E9.5) synliga för riktad DNA-lösningen injektion i ventriklar och nål elektroder typ insättning till målet hjärnan området 5,6. Den mönstring av hjärnan som kortikala område förekomma i tidiga fosterstadiet, därför dessa tidiga elektroporation från E9.5 ge ett stort bidrag för att förstå hela evenemangsområdet mönstring. För det andra hindrar den exakta formen av en kapillär livmodern skador genom att göra hål genom tillägg av kapillär. Dessutom är den exakta formen på nålen elektroder skapas med volfram och platina tråd och slipas med sandpapper och isolerad med nagellack 7, en metod som beskrivs i detalj i detta protokoll. Denna unika teknik gör det möjligt transfektion av plasmid DNA i begränsade områden av hjärnan och gör det möjligt för små embryon electroporated. Detta kommer att hjälpa till, öppna ett nytt fönster för många forskare som arbetar på celldifferentiering, cell migration, axon vägledning i mycket tidiga fosterstadiet. Dessutom kommer denna teknik hjälper forskarna att transfektera plasmid-DNA i djupa delar av den växande hjärnan såsom thalamus och hypothalamus, där inte många region-specifika CRE linjer finns för få av funktion (GOF) eller förlust av funktion (LOF) analyser.
I detta protokoll beskrivs vi bara fördelar med tekniken i pCAG-EYFP transfektion till begränsat område av en liten embryonal hjärna med hjälp av olika formade elektroder. För jämförelse av transfektion effektivitet genom olika promotor beskrivs tidigare, som visar specificiteten celltyp 1. Det finns dock begränsningar för tekniken, exempelvis transfektion bara är övergående och varierar beroende på plasmiden, har den inte någon cell specificitet och det är svårt att kontrollera antalet transfekterade cellerna. ThereforeHowever kommer att kombinera detta protokoll med andra tekniker ytterligare ge möjligheter för olika manipulation metoder. Först kommer integrera cellens specifika promotorn i plasmid-DNA kan celltyp specifika transfektion, som nervceller, gliaceller och astrocyter. För det andra, eftersom transfektion är övergående, är det inte lämpligt för forskare som vill analysera funktionen av genen senare i livet. Därför kommer tillsammans med en transposase att göra plasmid-DNA integreras i genomet omvandla den till en stabil transfektion 8. Sedan antagandet av Tet-på eller Tet-off-systemet gör det möjligt att manipulera tidpunkten eller cellen typspecifika genuttryck i neurala celler 8. Alternativt kan man kombinera detta protokoll med tamoxifen-inducerbara Cre-ER (T) recombinases 9 och möss reporter 10.
Denna breda tillgängligheten av vävnader kommer att drastiskt förändra experimentell design används i neurovetenskap.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (tilldelas TS) och RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, tilldelas MK) RIKEN Brain Science Institute (BSI), Human Frontier Science Program (HFSP) (tilldelas TS) och RIKEN Junior Research Associate Program (JRA, tilldelas MK) finansierat detta arbete.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
bare tungsten wire diameter 125 μm | A-M systems | 797600 |
bare platinum wire diameter 125 μm | A-M systems | 767000 |
Stick electrodes | Nepa gene | CUY610P4-1 |
glass capillary tube | Stoelting | 50611 |
micromanipulator | KD Scientific | KDS310 |
scissors | ROBOZ | RS-5865 |
pulse generator | A-M Systems | Model 2100 |
9 mm autoclip | ROBOZ | RS-9260 |
gold-plated pins | WPI | 5482 |
RORc antibody | Perseus Proteomics | H3925 |