이 프로토콜은 림프절의 조각에 소개 이미지 형광 T 세포 수있는 방법을 설명합니다. 이 기술은 전통적인 위드 형광 또는 공촛점 현미경과 T 세포의 마이 그 레이션의 실시간 분석을 수 있습니다.
드문 표현 항원을 감지 주변 림프절을 포함하여 이차 림프 기관에 나이브 T 세포는 지속적으로 트래픽이. 림프절에 T 세포의 마이 그 레이션 chemokines 포함한 세포 화학 두 요소를 포함 복잡한 과정이다. 최근 두 광자 현미경의 사용은 그대로 림프절의 T 세포를 추적하고 다른 세포들과 그들의 행동과 상호 작용을 몇 가지 양적 정보를 추출하는 것은 허용하고 있습니다. 생체내 시스템에 명백한 이점이 있지만,이 방법은 복잡하고 비싼 장비가 필요하며 조직에 제한적으로 액세스할 수 있습니다. murine 림프절 내에서 T 세포의 동작을 분석하기 위해, 우리는 슬라이스 분석 1, 원래 neurobiologists로 설정하고 murine thymus 2 최근 바뀜을 개발했습니다. 이 기법에서는 찬란 라벨이 T 세포는 심하게 준비 림프절 슬라이스 위에 도금입니다. 이 비디오 문서에서는 조직에 T 세포의 현지화 및 마이 그 레이션은 위드 필드와 공촛점 현미경으로 실시간으로 분석됩니다. 생체내에서 두 광자 현미경은 그들의 자연 환경에서 이미지를 T 세포에 대한 효과적인 접근 방식을 제공하며, T 세포의 마이 그 레이션을 기본 메커니즘을 명료하게하다 보완하는 기술.
우리는 도입 T 세포의 동작을 조사하는 데 사용되는 림프절의 조각을 생성하는 간단한, 빠르고 강력한 기술을 설명합니다. 최근에는이 방법이 성공적으로 T 세포의 위치와 운동성 1.5을 제어하는 세포 요소를 식별 thymic 및 림프절의 조각을 사용하여 적용되었습니다. 또한 긍정적인 선택을하는 동안 및 항원 인식 2,6에 따라 T 세포 thymocytes에서 칼슘 2 + 반응을 측정하는 데 사용되었습니다. 오버레이 슬라이스 분석은 장점과 논의가 될 자격 제한을 선물한다. 한 요구가 셀 마이 그 레이션의 분자 제어 방해하기 위해 pharmacologically 조각을 조작하는 경우의,이 시스템은 유용 조직에 액세스할 수 있습니다. 이미징 이후에, 조각이 몇 군데있다 구조에 대한 자세한 정보를 수집 immunohistochemistry에 대해 처리할 수 있습니다. 또한, 관찰은 전통적인 위드의 형광 현미경으로 만들 수 있습니다. 해상도 공촛점 또는 두 광자 현미경으로만큼 좋지 않아 그 phototoxicity은 원칙적으로 두 개의 광자 현미경보다 한 광자 더욱 심각한 있지만, 그것은 단순의 이점, 낮은 비용, 더 큰 선택의 여지가 여기 파장의.
손상 림프절의 T 세포의 이미지가 표시 lymphocytes의 정맥 주사가 필요 림프 기관으로 연속적으로 가정되는. 우리가 이전에 1 보여준 바와 같이, 슬라이스 분석은 입양 전달 실험과 완벽하게 호환됩니다. 그러나, 림프절에 집에 T 세포에 필요한 시간의 길이는 시간이지나면서 세포 밖으로 누설하는 경향을 형광 염료의 사용을 복잡하게하실 수 있습니다. 이것은 칼슘 2 + 염색 fura – 2의 경우입니다. 조직에 T 세포의 빠른 채용 (<30 분)으로 슬라이스 분석은 염료를 사용하는 기회를 제공합니다. 마지막으로,이 방법은 여러 사람이 조직에서 T 세포의 기능을 분석할 수있는 큰 장점 살려두고있다.
이 실험 시스템은 또한 염두에 보관해야합니다 한계를 제공합니다. 깔끔히과 관련된 손상이 특히 상처 표면 근처의 조직의 표면 영역에서 T 세포의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다. 슬라이스 내에서 세포 죽음을 평가하기 위해, 우리는 타협 플라즈마 막과 세포를 관통하는 형광 염료 SYTOX 녹색을 사용했습니다. 우리의 실험은 주로 조직의 표면 지역화된 총 결절 세포의 약 20 %가 찬란이 핵 염색으로 표시라고 밝히지. 분석과 함께 또 다른 잠재적인 우려 chemokines 포함하여 중요한 가용성 요소를 유지하는 조각의 능력입니다. 우리는 T 세포가 슬라이스 내에 좋은 운동성를 표시 이후의 데이터는 이러한 문제에 의해 영향을 받았다고한다는 표시도없고,하지만, 우리는 상처 표면에서 마이크론의 여러 수십에 위치하고 건강한 지역 이미징 T 세포의 중요성을 강조하고 싶습니다. 이것이이 프로토콜에 같은 전통적인 현미경 (위드 필드 또는 공촛점)와 함께 할 수, 반면에, 그것은 림프절 슬라이스 준비가 두 광자 영상은 깊이에 공간적 해상도를 향상시키고 phototoxicity을 줄일 수와 결합 가능성이 높습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 우리가 림프 노드 조각을 수행하는 것이 좋습니다 박사 알랭 Trautmann 감사하고 싶습니다. 이 작품은 리그 Nationale Contre 르 암, Fondation 부어 라 레쳐치 Médicale 엉 프랑스와 협회 부어 라 공들인 쉬르 르 암에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Confocal microscope | Leica | SP5 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Fine Forceps | World Precision Instruments | 14142 | |
30 mm Culture inserts | Millipore | PICM0RG50 | |
RPMI | Invitrogen | 61870010 | Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin |
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
Low gelling temperature Agarose, type VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond | 3M | 1469 | |
Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter | DIY store | ||
Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |