Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Экс естественных изображений Т-клеток у мышей фрагменты лимфатических узлов с Широкоугольные и конфокальной Микроскопы

doi: 10.3791/3054 Published: July 15, 2011

Summary

Этот протокол описывает метод изображения флуоресцентного Т-клетки вводятся в лимфатические узлы ломтиками. Техника позволяет в режиме реального времени анализ миграции Т-клеток с традиционными широкопольных флуоресценции или конфокальной микроскопии.

Abstract

Наивные Т-клетки непрерывно трафик на вторичных лимфоидных органах, в том числе периферических лимфатических узлов, для выявления редких выразил антигенов. Миграцию Т-клеток в лимфатические узлы является сложным процессом, который включает как сотовая и химических факторов, включая хемокинов. В последнее время использование двух-фотонной микроскопии позволило отслеживать Т-клеток в интактных лимфатических узлов и получить некоторые количественные данные об их поведении и их взаимодействие с другими клетками. Хотя Есть очевидные преимущества в системе естественных условиях, этот подход требует сложных и дорогостоящих приборов и обеспечивает ограниченный доступ к ткани. Для анализа поведения Т-клеток в мышиный лимфатических узлов, мы разработали срез анализа 1, первоначально созданная нейробиологов и транспонированной недавно мышиного тимуса 2. В этой технике, флуоресцентно меченных Т-клетки высевают на вершине остро подготовлена ​​часть лимфатических узлов. В этом видео-статьи, локализации и миграции Т-клеток в ткани, анализируются в режиме реального времени с широкопольных и конфокальной микроскопии. Техника, которая дополняет в естественных условиях двухфотонного микроскопии предлагает эффективный подход к изображению Т-клеток в их естественной среде и выяснить механизмы, лежащие Т-клеток миграции.

Protocol

1. Подготовка ломтики из лимфатических узлов

  1. Подготовка 4% низкой температурой плавления агарозы решение для вложения. Развести агарозы в ФБР и СВЧ этого решения. Когда агарозном полностью растворяется, поддерживать решения при 37 ° С до готовности к использованию.
  2. Подготовка 6-и культуре ткани пластины. Добавить 1,1 мл полной среды RPMI культуры на лунку, и вставьте органотипической фильтр в каждую лунку. Место 6-луночный планшет при 4 ° С до готовности передать ломтиками.
  3. Место шайб из нержавеющей стали, с внутренним диаметром 4 мм, в пластиковых блюдо заполнено RPMI полной среде. Шайбы будут в дальнейшем использоваться для концентрации клеток на vibratome часть разреза.
  4. Жертва мыши в соответствии с местными правилами содержания животных. Осторожно снимите периферических лимфатических узлов от окружающей ткани и поместите их в пластиковый блюдо с ледяным PBS. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить структуру лимфатических узлов, так как эти органы очень мягкий.
  5. Залить 4%-ном агарозном геле в 35-мм пластиковые тарелки и деликатно передачи узлов в гель. Оставьте агарозном геле на льду в течение 5 мин, чтобы укрепиться.
  6. Удалить блок из тарелки и отделка агар, чтобы оставить 3-5 мм геля вокруг каждого лимфатических узлов.
  7. Прикрепить вложенных узлов на образец диска vibratome с использованием нетоксичных ткань клеем. Установить образец диска в лотке со льдом, холодной PBS.
  8. Раздел агар-встроенные ткани на 320 мкм толщины с vibratome скорости установлен на медленном диапазоне (0,3 мм / с) и частоту колебаний установлен на средней дистанции (1,5 мм).
  9. Тщательно передачи ломтиками лимфатических узлов, как они сокращаются на органотипической вставками культуры с использованием тонких щипцов. Место 3 ломтика на каждой вставки. Использование большой осторожностью, как ломтики могут быть легко повреждены. Типичный периферических лимфатических узлов даст 5 секций при разрезании на 320 мкм. Откажитесь от первого и последнего ломтиками, так как они содержат только поверхностные ткани.
  10. Место шайб из нержавеющей стали на каждом отдельном срезе. Убедитесь в том, шайбы, хорошо позиционируется на агарозном окружающие ткани.
  11. Инкубируйте культуру пластины при температуре 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора увлажненный до готовности пластины Т-клеток.

2. Изоляция Т-клеток от мышей лимфатических узлов

  1. Изолировать Т-клеток в соответствии с ранее опубликованной статье Юпитер 3.
  2. Использование Т-клетки сразу и переходите к следующему разделу. В противном случае, лимфоциты могут быть культурным ночь в полной RPMI-среде с добавлением 10 нг / мл ИЛ-7.

3. Маркировка изолированных Т-клетки

  1. Вымойте клеток в HBSS. Ресуспендируют их в том же буфере при 10 х 10 6 на мл.
  2. Добавить такой же объем HBSS, содержащей 1 мкМ сотовый Tracker зеленый CMFDA давая конечной концентрации 0,5 мкМ.
  3. Инкубируйте клеточной суспензии при температуре 37 ° С в течение 5 мин. Вымойте клетки в два раза с полной RPMI-среде.
  4. Ресуспендируют клеток в конечной концентрации 10 х 10 6 на мл в полной RPMI-среде. Эти меченые клетки будут покрыты на ломтики.

Другие флуоресцентных красителей, чем CMFDA может быть использован тоже, но имейте в виду, что эти молекулы являются потенциально токсичными выше определенных концентраций.

4. Покрытие помечены Т-клеток на ломтики лимфатических узлов

  1. Удалите излишки средой, содержащиеся в внутренней части шайбы с пипеткой. Не позволяйте ткани становятся сухими, работают быстро на этом этапе.
  2. Аккуратно обойтись от 10 до 20 мкл меченых Т-клеток, что соответствует 1 до 2 х 10 5 клеток на внутренней части стиральной машины. Необходимо соблюдать осторожность и не прикасайтесь к ткани с кончика пипетки. Будьте уверены, что капля суспензии клеток остается на месте.
  3. Место срезов клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы лимфоциты мигрируют в ткани.

5. Изображений Т-клеток в лимфатических узлах ломтиками

В этом видео-статьи, мы флуоресцентные изображения Т-клеток в лимфатических узлах ломтики широкопольных инвертированного микроскопа и конфокальной прямой микроскоп.

  1. Установите температуру на 37 ° C. Наши микроскопы оснащены регулируемой температурой камеры.
  2. Установить перфузии система, позволяющая непрерывной перфузии ломтик лимфатических узлов с кислородом (5% CO 2, 95% O 2) фенола красного среде без RPMI. В нашей системе перфузии СМИ входит в изображение камеры с одной стороны, под действием силы тяжести. Среды атмосферный с насос, подключенный к колбе сбора отходов. Установите частоту рабочих сред до 1 мл / мин.
  3. С тонкой пинцетом, осторожно вынуть часть из 6-луночного планшета и падения подготовки в подогретом кислородом RPMI среду в течение нескольких секунд, чтобы избавиться от флуоресцентных клетки не проникла в ткань.

ИмаГинг Т-клеток с широким полем инвертированного микроскопа

  1. Место среза вверх тормашками на заказ изображений камеру, которая состоит из нейлона темы наклеиваются на внутреннюю часть блюдо стеклянным дном. В этой камере, нейлон темы поднять часть из стекла и позволяют кислородом решение диффундируют в ткани. Это необходимо, как Т-клеток миграции в лимфатические узлы сильно зависит от кислорода. Безопасные срез, добавив на него шайбу из нержавеющей стали. В этих условиях часть лежит несколько микрон над дном тарелку, которая способствует обновлению перфузии раствором.
  2. Чтобы захватить большое поле зрения (800 х 800 мкм, примерно треть срез поверхности узла), собирать изображения, используя 10-кратный объектив сухой. Мы обнаружили, что 10-кратный Nikon S фтора 0,5 Н.А. была наиболее подходящей для нашего анализа.

Типичный покадровой визуализации эксперимент захватывает 5 оптических самолетов охватывающей общей глубиной 50 мкм в осевом (г) измерение. Флуоресцентные Т-клетки, как правило, отображаемого с интервалами от 10 до 30 секунд, в течение от 10 до 20 мин.

Изображений Т-клеток с конфокальной прямой микроскоп

Конфокальной микроскопии, используемые в настоящем протокол Leica SP5 оснащена 20-кратным погружения в воду цель (Olympus, 20x/0.95 NA).

  1. Безопасные квант изображения столик микроскопа. Примечание: Мы обычно помещают шайбу на подготовку, чтобы обездвижить его.
  2. Установить изображений сессии, собирая серии изображений по оси. Чтобы создать образ Т-клеток в нетронутой структуру ткани, исходное положение, как правило, установлен на уровне от 5 до 10 мкм ниже первого помечены Т-клеток.

6. Представитель результаты

Следуя этой видео-протокол, который вы должны ожидать, чтобы визуализировать большое количество Т-клеток, люминесцентные, накопленных в Т зоне узла, явление, которое обычно происходит в этой конкретной среды в естественных условиях (рис. 1). В частности, Т-клетки должны быть исключены из зоны B клетки, которые обычно как раз под капсулой. Успешный эксперимент также приведет к Т-клетки призыву в ткани (рис. 2), показывая очень подвижны поведения (рис. 3) в соответствии с опубликованными результатами, полученные в нетронутой лимфатических узлов 4. В среднем, средняя скорость отдельных Т-клеток в ломтиков должна быть близка к 10 мкм / мин (рис. 4).

Рисунок 1
Рисунок 1. Т-клетки накапливаются в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клеток (CMFDA, зеленый) были добавлены к ломтик лимфатических узлов за 30 минут до получения изображения (верхний рисунок). Изображение максимальный выступ 5 изображений охватывающих 50 мкм в направлении оси Z.. Яркий образ поля приведена на дно. Изображения были захвачены с помощью микроскопа широкопольных.

Рисунок 2
Рисунок 2. Т-клетки вербуют в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клеток (CMFDA, зеленый) были добавлены к ломтик лимфатических узлов за 30 минут до получения изображения использованием конфокальной микроскопии. Изображения были захвачены на поверхности разреза (верхний рисунок) и 40 мкм ниже (нижний рисунок).

Рисунок 3
Рисунок 3. Т-клетки чрезвычайно подвижны в ломтик лимфатических узлов. Флуоресцентно меченных Т-клетки были обследованы в течение 12 мин с использованием микроскопа широкопольных. Траектории отдельных клеток Т отображаются в виде цветных треков представляют увеличения смещения от синего (низкая подвижных клеток) до красного (высокий подвижных клеток). Треки были рассчитаны с использованием Imaris программного обеспечения. Белая линия следующим край узла, в то время как пунктирные овальной разграничивает зоны предполагаемого клеток.

Рисунок 4
Рисунок 4. В ломтик лимфатических узлов, скорость Т-клеток, близка к 10 мкм / мин. Скорости были рассчитаны с использованием программного обеспечения от Imaris треки представлены на рисунке 3.

Discussion

Мы описали простой, быстрый и надежный способ для генерации лимфатических узлов ломтиками, которые используются для исследования поведения введен Т-клеток. В последние годы этот метод был успешно применен использованием тимуса и кусочками лимфатических узлов для определения внеклеточных факторов, контролирующих Т позиционирования клетки и подвижность 1,5. Он также был использован для измерения Са 2 + ответов в тимоцитов при положительном отборе и в Т-клетках после распознавания антигена 2,6. Анализ наложения срез представляет преимущества и ограничения, которые заслуживают того, чтобы обсуждать. Следует отметить, что эта система обеспечивает доступ к ткани, полезно, если нужно манипулировать ломтиками фармакологически для того, чтобы вмешиваться в молекулярный контроль миграции клеток. После обработки изображений, ломтики могут быть обработаны для иммуногистохимии для сбора дополнительной информации о структурах, которые были в образ. Более того, наблюдения могут быть сделаны с традиционными микроскоп флуоресценции широкопольных. Хотя резолюция не так хорошо, как с конфокальной или двухфотонного микроскопа и фототоксичности, что, в принципе, более серьезные с однофотонной, чем с двухфотонной микроскопии, она имеет преимущества простоты, низкой стоимости, и более широкого выбора возбуждения волн.

Изображений Т-клеток в здоровом лимфатических узлов требует внутривенного введения меченых лимфоцитов, которые впоследствии домой лимфоидных органах. Как было показано ранее 1, часть анализа вполне совместим с приемными эксперимент перевода. Тем не менее, время, необходимое для Т-клеток на главную в лимфатические узлы могут осложнить использование флуоресцентных красителей, которые имеют тенденцию к утечке из клеток с течением времени. Это случай Са 2 + краситель Фура-2. С быстрым набора (<30 мин) Т-клеток в ткани, срез анализа дает возможность использовать такие красители. Наконец, этот метод имеет большое преимущество для анализа Т клеточных функций в некоторых тканях человека оставлял в живых.

Эта экспериментальная система представляет также ограничения, которые необходимо иметь в виду. Повреждения, связанные с нарезки может повлиять T функционирования клеток, особенно в области поверхностных тканей вблизи поверхности среза. Для того чтобы оценить гибели клеток в срезе, мы использовали флуоресцентный краситель SYTOX зеленый, который проникает клетки с ослабленной плазматической мембраны. Наши эксперименты показывают, что около 20% от общего числа клеток узловой, в основном локализована в области поверхностных тканей, были помечены флуоресцентно этого ядерного красителя. Другая потенциальная проблема с анализа является способность ломтиками сохранить важные растворимых факторов, включая хемокинов. Хотя, у нас нет никаких признаков того, что наши данные были затронуты такие проблемы, так как Т-клетки дисплей хорошей подвижности в ломтик, мы хотели бы подчеркнуть важность изображений Т-клеток у здоровых регионов, расположенных в несколько десятков микрон от поверхности среза. Принимая во внимание, это может быть сделано с традиционными микроскопы (широкопольных или конфокальной), как в этот протокол, вполне вероятно, что часть лимфатического узла подготовки в сочетании с двухфотонного изображения увеличится пространственное разрешение по глубине и снижения фототоксичности.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Ален Траутманн, который призвал нас провести ломтиками лимфатических узлов. Эта работа была частично поддержана грантами от Национальной лиги Contre ле Рак, Фонд залить La Recherche Medicale ан Франции и Ассоциацией залить La Recherche сюр-ле-Рака.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscope Leica Microsystems SP5
Vibratome Leica Microsystems VT1200S
Fine Forceps World Precision Instruments, Inc. 14142
30 mm Culture inserts EMD Millipore PICM0RG50
RPMI Invitrogen 61870010 Complete RPMI-medium is made by adding 10 % heat-inactivated fetal calf serum and Penicillin/streptomycin
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) Invitrogen 14170088
Low gelling temperature Agarose, type VII-A Sigma-Aldrich A0701
Butyl Cyanoacrylate Glue, Vetbond 3M 1469
Stainless steel washers, 4 mm of inner diameter Any Supplier
Cell Tracker green CMFDA Invitrogen C7025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
  2. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
  3. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. (2007).
  4. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
  5. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
  6. Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
<em>Экс естественных</em> изображений Т-клеток у мышей фрагменты лимфатических узлов с Широкоугольные и конфокальной Микроскопы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Salmon, H., Rivas-Caicedo, A., Asperti-Boursin, F., Lebugle, C., Bourdoncle, P., Donnadieu, E. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. (53), e3054, doi:10.3791/3054 (2011).More

Salmon, H., Rivas-Caicedo, A., Asperti-Boursin, F., Lebugle, C., Bourdoncle, P., Donnadieu, E. Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes. J. Vis. Exp. (53), e3054, doi:10.3791/3054 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter