हम साल्मोनेला enterica serovars Enteritidis, Hadar, हीडलबर्ग, और typhimurium के तेजी से पता लगाने के लिए एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर का वर्णन करता है. विशिष्ट साल्मोनेला serovars एक जीन और हे प्रतिजन biosynthesis और एक दिया serovar के क्लस्टर flagellin अद्वितीय दृश्यों के लिए पीसीआर मल्टीप्लेक्स लक्ष्यीकरण द्वारा पहचाना जा सकता है. Serovar तो एक साल्मोनेला को सौंपा है अलग विशिष्ट आकार की (पीसीआर उत्पाद) amplicons लक्ष्य एलील के संगत की उपस्थिति पर आधारित है.
वर्तमान साल्मोनेला लक्ष्य इस जीनस के लिए अद्वितीय जीन की पहचान करने के लिए वाणिज्यिक PCRs परीक्षण. हालांकि, वहाँ दो प्रजातियों, छह उप प्रजातियों, और 2,500 से अधिक विभिन्न साल्मोनेला serovars हैं, और नहीं सब उनके महत्व में सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए बराबर हैं. उदाहरण के लिए, एस ढूँढने enterica एक मेज अंडे परत खेत पर उपप्रजाति IIIa एरिज़ोना एस के अलगाव की तुलना में नगण्य है enterica उपप्रजाति मैं serovar Enteritidis, सलमोनेलोसिज़ के प्रमुख कारण तालिका अंडे की खपत से जुड़े. Serovars lipopolysaccharide में प्रतिजनी मतभेदों (LPS) (हे प्रतिजन) और flagellin (H1 और H2 प्रतिजनों) के आधार पर पहचाने जाते हैं. ये प्रतिजनी मतभेदों इस phenotype के साथ जुड़े जीन और जीन alleles की विविधता के जावक उपस्थिति हैं.
हम एक allelotyping विकसित मल्टीप्लेक्स पीसीआर है, कि चार प्रमुख एस के बीच आनुवंशिक अंतर पर चाबी enterica उपप्रजाति मैं serovars पोल्ट्री में पाया है और अमेरिका में महत्वपूर्ण मानव रोग के साथ जुड़े. पीसीआर प्राइमर जोड़े कुंजी जीन या एक विशिष्ट साल्मोनेला serovar के लिए अद्वितीय और दृश्यों कि जीन या एलील के लिए विशिष्ट आकार के साथ एक amplicon उत्पादन डिजाइन के लिए लक्षित थे साल्मोनेला serovar के लिए एक विशिष्ट LPS के लिए पीसीआर परीक्षण के परिणाम के संयोजन के आधार पर अलग सौंपा और flagellin जीन alleles. मल्टीप्लेक्स इस आलेख में वर्णित PCRs एस का पता लगाने के लिए विशिष्ट हैं उपप्रजाति मैं serovars Enteritidis enterica, Hadar, हीडलबर्ग, और साल्मोनेला.
यहाँ हम प्रदर्शन कैसे मल्टीप्लेक्स PCRs का उपयोग करने के लिए साल्मोनेला के लिए serovar पहचान अलग है.
अधिकांश व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साल्मोनेला लक्ष्य जीनस (उदा. invA) अद्वितीय जीन का पता लगाने के के लिए पीसीआर परीक्षण . हालांकि, नहीं सभी साल्मोनेला उनके लिए मनुष्य या जानवर आबादी में प्रसार में रोग पैदा करने की क्षमता में बराबर हैं. साल्मोनेला हे प्रतिजन LPS और flagellinH1 और H2 प्रतिजनों में प्रतिजनी मतभेदों के प्रारंभिक पहचान 2,500 से अधिक इन प्रतिजनी मतभेदों पर आधारित serovars में साल्मोनेला के भेदभाव करने के लिए नेतृत्व किया है. वहाँ 46 अलग हे प्रतिजनों और 86 अलग flagellin एंटीजन (एच) जीनस साल्मोनेला में पहचान कर रहे हैं साल्मोनेला (H1) या दो अलग अलग flagellins (H1 और H2) के अधिकारी हो सकता है. आज हे, H1 और H2 2500 साल्मोनेला serovars के लिए प्रतिजनों खाते के विभिन्न संयोजन को मान्यता दी . एक serovar प्रतिजनी व्यक्तिगत हे और एच प्रतिजनों की पहचान से व्युत्पन्न फार्मूला पर आधारित सौंपा है. हे प्रतिजनी सूत्र के रूप में लिखा है:: H1 H2, और कहाँ "" हे प्रतिजन के लिए नकारात्मक साल्मोनेला के लिए H1 H2 या flagellin और "NT" (गैर typeable) के अभाव के लिए संदर्भित करता है. उदाहरण के लिए, serovar typhimurium एक एस के लिए सौंपा है मैं: enterica प्रतिजनी सूत्र बी के साथ अलग 1,2 जबकि Enteritidis एक सूत्र D1 के साथ अलग करने के लिए दिया जाता है: जी, मीटर : -. साल्मोनेला आबादी में इस प्रतिजनी परिवर्तन nucleotide स्तर है कि इसलिए आसानी से पीसीआर द्वारा शोषण किया जा सकता है पर मतभेद की जावक अभिव्यक्ति है.
हम आनुवंशिक विशिष्ट हे और एच alleles के साथ जुड़े की पहचान एस के लिए एक allelotyping पीसीआर विकसित मतभेद की पहचान की है enterica serovars: Enteritidis, Hadar, हीडलबर्ग और typhimurium (3). Hadar (C2: z10 के: ई, एन, एक्स), Heidelberg (बी – H1: H2 Enteritidis प्रतिजनी सूत्र (D1:: जी, मीटर) सही और साल्मोनेला serovar का काम रिपोर्टिंग सब ओ के साथ जुड़े alleles के लिए परीक्षण की आवश्यकता r: 1,2), और typhimurium (बी: मैं: 1,2). हे एलील या प्रतिजन H1 जी की खोज के ज्ञान के बिना, मी एलील अकेले जरूरी अन्य साल्मोनेला serovars रूप Enteritidis के रूप में साल्मोनेला अलग पहचान नहीं करता है: Agona, कैलिफोर्निया, और मोंटेवीडियो, भी इसी एलील अधिकारी. जबकि allelotyping पीसीआर मूल का पता लगाने के लिए पहले साल्मोनेला serovars उल्लेख किया है डिजाइन किया गया था, इस परीक्षण के एक अतिरिक्त 19 serovars (3 टेबल) की पहचान कर सकते हैं. हमारे allelotyping पीसीआर मूल हे और एच alleles का पता लगाने के लिए डिजाइन किया गया था. अभ्यास में, यह और अधिक व्यावहारिक और लागत प्रभावी बन गया है हमारे लिए हे स्लाइड समूहन परीक्षण द्वारा प्रतिजन की पहचान करने के लिए, antisera हे विशिष्ट का उपयोग, के बजाय प्रदर्शन हे allelotyping पीसीआर जब पृथक साल्मोनेला संस्कृतियों के साथ काम कर रहे है. हालांकि, हम हे allelotyping पीसीआर का उपयोग कर की सिफारिश करते हैं अगर आपके प्रयोगशाला या साल्मोनेला मुक्त व्यापार समझौते कार्ड (6) पर प्रस्तुत आइसोलेट्स टाइपिंग के लिए एक स्क्रीन (2) के रूप में इस पीसीआर का उपयोग करता है, और शामिल एक साल्मोनेला विशिष्ट नमूनों की पहली स्क्रीन के साथ पीसीआर ( 4 ). कि साल्मोनेला के रूप में पीसीआर या जैव रासायनिक / प्रतिजनी परीक्षण के द्वारा की पहचान कर रहे हैं केवल उन नमूनों allelotyping PCRs सीमा.
इस आलेख में वर्णित प्रोटोकॉल Idaho प्रौद्योगिकी Rapidcycler, एक गर्म हवा thermocycler है कि एक नीचे पैमाने पर करने के लिए कई हीटिंग ब्लॉक thermocyclers से भी कम समय में प्रतिक्रिया मात्रा और रन स्थितियों की प्रतिक्रिया की अनुमति देता है के साथ प्रयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है. प्राइमर सांद्रता समायोजन;, या MgCl दो सांद्रता का समायोजन एक हीटिंग ब्लॉक thermocycler के साथ प्रयोग के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल स्थितियों की प्रतिक्रिया empirically कम / annealing तापमान बढ़ाने के द्वारा अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, हम एम.जे. PTC-200 thermocycler के रूप में इस प्रकार अनुसंधान के लिए प्रोटोकॉल अनुकूल पड़ा है. ही प्रतिक्रिया तालिका 1 में वर्णित संस्करणों के साथ कार्य करना, काम कर रहे स्टॉक concentrationof मैं प्राइमर सेट 2.5 सुक्ष्ममापी को पतला था, annealing तापमान 55 डिग्री सेल्सियस 45 ° कदम, सी और विकृतीकरण पर ऊष्मायन बार, annealing और विस्तार से उतारा गया मैं / जी, मीटर allelotyping पीसीआर के लिए 20 s से lengthened गया था. उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण होने प्रारंभिक शुरू और किसी भी पीसीआर के लिए अनुकूलन प्रकाशित प्रोटोकॉल सहित में आवश्यक हैं. हम ज्ञात साल्मोनेला serovars प्राप्त करने की सिफारिश, विशेष रूप से Anatum (E1: ई, ज: 1,6), (: जी, मीटर: D1 -) Enteritidis, Hadar (C2: z10 के: ई, n, x), Heidelberg (बी : r : 1,2), मोंटेवीडियो (C1: जी, मीटर, एस: 1,2,7) और typhimurium (बी: मैं: 1,2); आदि और एक प्रयोगशाला Escherichia कोलाई K12 (DH5α, LE393, तनाव JM109 ) क्रमशः allelotyping पीसीआर इस आलेख में वर्णित परीक्षण के लिए सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में. इन साल्मोनेला serovars के कई एलील जो परीक्षण किया है पर निर्भर करता है, या तो सकारात्मक या नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे.
कुछ सावधानियों और दिशा निर्देशों के लिए पीछा किया जाना है जबकि इस और किसी भी अन्य नैदानिक पीसीआर प्रदर्शन की जरूरत है. सबसे पहले, भौतिक जुदाईतैयारी के टेम्पलेट, पीसीआर सेट अप, और जेल वैद्युतकणसंचलन रोकने संभव पीसीआर संदूषण और झूठी सकारात्मक की गलत रिपोर्टिंग ध्वंसावशेष में महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, उचित नियंत्रण के किसी भी दिनचर्या पीसीआर में शामिल होने आवश्यक है इन नियंत्रणों के रूप में समस्याओं की पहचान के रूप में वे उत्पन्न होती हैं और परिणाम की व्याख्या (5) करने में सहायता. सबसे महत्वपूर्ण बात, स्थिरता amplicon (पीसीआर उत्पाद) amplicon आकार का पता लगाने andestimation के लिए electrophoretic शर्तों के संबंध के साथ, विशेष रूप से आवश्यक है. इस बिंदु को वर्णन करने के लिए, हम जानबूझकर वैद्युतकणसंचलन पहले की तुलना में चित्रा 1A में करना निलंबित. आणविक भार मानकों (1 गलियों और 13) और सकारात्मक नियंत्रण (2 लेन) पर्याप्त के लिए सही आकार का अनुमान या डीएनए टुकड़े जहां वहाँ आकार में छोटे मतभेदों (~ 50 बीपी) की जुदाई का पालन करने के लिए अलग नहीं कर रहे हैं. डीएनए टुकड़े के पर्याप्त जुदाई, विशेष रूप से आणविक भार मानकों, सकारात्मक रिपोर्टिंग amplicon आकार और भेद से गैर विशिष्ट amplicons है कि कभी कभी किसी भी पीसीआर (5 के दैनिक चलाने में मनाया जाता है "सच सकारात्मक" का सटीक आकलन पर निर्भर करता है के रूप में आवश्यक है ). उदाहरण के लिए, वहाँ चित्रा 1B, 7 लेन (~ 700 बीपी आकार में) में एक गैर विशिष्ट amplicon है. अगर वैद्युतकणसंचलन बहुत जल्दी बंद कर दिया गया, जब डाई सामने agarose जेल में आधे रास्ते बिंदु पर ही था, वहाँ 500 बीपी और 700 बीपी डीएनए टुकड़े के बीच थोड़ा भेदभाव होगा. इसलिए, 7 गली में नमूना ग़लती से किया गया है दोनों मैं और जी, मीटर alleles के लिए के रूप में सकारात्मक रिपोर्ट.
अंत में, किसी भी परीक्षा के साथ जुड़े सीमाओं को पहचान करने की जरूरत है. 1,5,, 1,6, 1,7 प्रतिजन जटिल, ई, n, x / ई H1/H2 allelotyping पीसीआर के कई भेदभावपूर्ण alleles में सूक्ष्म आनुवंशिक मतभेद 1,2 H2 से संबंधित विचार की शक्ति नहीं है , पता, z15 प्रतिजन जटिल और H1 जी प्रतिजन जटिल है, जो जी, मीटर एलील शामिल है. एक या दो एमिनो एसिड परिवर्तन खाते के लिए अलग epitopes इन flagellar प्रतिजनों में मौजूद है. इसलिए यह हमारे लिए प्राइमरों कि flagellin जीन अनुक्रम (3) में ये कभी – कभी एकल आधार जोड़ी मतभेद का फायदा उठाने सकता है डिजाइन करने के लिए मुश्किल था. उदाहरण के लिए, साल्मोनेला serovars डबलिन (D1: जी, पी: -) और Berta (D1: टी – च, छ:) भी कर रहे हैं हमारे जी के साथ सकारात्मक पीसीआर, mallelotyping प्राइमरों . ब्रैडफोर्ड (r: B 1,5), Heidelberg (1,2 बी:: आर) (: मैं बी 1,5) लागोस से H2 allelotyping प्राइमरों typhimurium (: मैं बी 1,2) भेद नहीं कर सकते हैं, Winneba (r: B 1,6), या रेमो Glostrup (बी: r: 1,7) से (C2: z10 के: ई, n, z15), या (ई, n, x: z10 के C2) Hadar. जबकि इन serovars के कुछ का सामना करने की संभावना: लागोस, ब्रैडफोर्ड, Winneba, रेमो या Glustrup दूरस्थ है, यह एक संभावना है और या तो परीक्षण की सीमा या किसी अन्य पुष्टि परीक्षण पर अस्वीकरण प्रदान की आवश्यकता है.
अंत में, इस पीसीआर आधारित serotyping तेजी एस पहचानती है enterica serovars Enteritidis, Hadar हीडलबर्ग, और typhimurium, और हे, H1, H2 alleles 19 अतिरिक्त serovars के साथ जुड़े. इस परख एक तेजी से, लागत प्रभावी पारंपरिक serotyping साल्मोनेला के लिए सूक्ष्मजीवविज्ञानी दृष्टिकोण के लिए वैकल्पिक है .
The authors have nothing to disclose.
यह काम USDA 1999-35212-8680 अनुदान, 2005-01378, और 2010-04288-01, USDA फार्मूला फंड और जॉर्जिया पशु चिकित्सा कृषि अनुसंधान अनुदान राज्य द्वारा समर्थित किया गया है. इस प्रकाशन में वर्णित प्रोटोकॉल स्नातक से नीचे के द्वारा निर्देशित अनुसंधान पाठ्यक्रम के हिस्से के रूप में उपयोग के लिए विकसित किया गया था: MIBO 4900L, जीन 4960H, 4960L BCMB, और जॉर्जिया विश्वविद्यालय में Biol 4960H और Maurer में कई आण्विक जानपदिक रोग विज्ञान अनुसंधान परियोजनाओं पर छात्रों द्वारा इस्तेमाल किया प्रयोगशाला. हम हमारे प्रयासों के अनुसंधान के साथ स्नातक अनुदेश एकीकृत का समर्थन करने के लिए कई स्नातक छात्रों जो Maurer ली और प्रयोगशालाओं में अनुसंधान का प्रदर्शन किया है, और हमारे विभाग की कुर्सी, जॉन Glisson धन्यवाद.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Luria Bertani | Fisher | (or any comparable source) | ||
Microfuge tubes | 1.5 ml capacity | Fisher | (or any comparable source) | |
Ethanol | 200 proof | Fisher | (or any comparable source) | |
dH2O | Molecular Biology Grade | Sigma | (or any comparable source; PCR only) | |
10 x PCR Buffer: | 20 mM MgCl2 | Idaho Technology | (buffer comes with BSA, Ficoll and Tartrazine) | |
30 mM MgCl2 | ||||
40 mM MgCl2 | ||||
PCR primers | ||||
DMSO | ||||
dNTP | Roche | (or any comparable source) | ||
Taq DNA Polymerase | Denville | (or any comparable source) | ||
Capillary pipettes | 10 μl volume | Idaho Technology | ||
Rapid Cycler | Idaho Technology | |||
Agarose | Low EEO; Molecular Biology Grade | BioRad | (or any comparable source) | |
50 X TAE Buffer or 5X TBE Buffer | Fisher | (or any comparable source) | ||
Ethidium bromide | BioRad | (or any comparable source) | ||
Horizontal, submersible gel electrophoresis chamber with gel mold | BioRad | (or any comparable source) | ||
Power supply | BioRad | (or any comparable source) | ||
Molecular Imager Gel Doc System | BioRad | (or any comparable source) |
Table 4. Materials