DT40、モデル脊椎動物の遺伝学的システムは、タンパク質の機能を解析する強力なツールが用意されています。ここでは、単一分子レベルでのDT40細胞におけるS期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定性的な分析を可能にするシンプルな方法を説明します。
複製フォークの安定の維持は可能性を維持し、病気を防ぐためにセルを分割するための最も重要なのです。関連するプロセスは、腫瘍の開発で認識原因となる要因を内因性と外因性DNA損傷の顔に忠実なゲノムの重複を確保するだけでなく、ゲノム不安定性を防ぐことだけ。
ここで、我々は、シンプルでコスト効率の良い蛍光顕微鏡ベースの鳥B -細胞株DT40のDNA複製を可視化する方法を説明します。この細胞株は、脊椎動物細胞1の逆遺伝学によるin vivoでのタンパク質の機能を調査する強力なツールが用意されています。特定の遺伝子を欠損DT40細胞におけるDNAの繊維のフルオログラフィーは1つがDNA複製とゲノムの安定性におけるこの遺伝子産物の機能を解明することができます。脊椎動物の細胞内で複製フォークの動態を分析する従来の方法は、パルス標識した細胞の集団におけるDNA合成の全体的な速度を測定することに依存しています。これは定量的なアプローチであり、DNA合成に影響を与えるパラメータの定性分析のために許可されていません。 DNAの繊維技術2-4を使用しているときとは対照的に、アクティブなフォークの動きの速度を直接追跡することができる。このアプローチでは、発生期のDNAは、ハロゲン化ヌクレオチドの取り込み(図1A)によって生体内でラベルが付けられています。その後、個々の繊維は顕微鏡のスライド上に引き伸ばされている、と標識DNAの複製の路は、特異的な抗体で染色し、蛍光顕微鏡(図1Bの)によって可視化されています。複製だけでなく、フォークの方向性の開始は、異なる2つの修正されたアナログの連続した使用によって決定されます。さらに、デュアルラベルをつける方法は、S期の間にDNA合成に影響を与えるパラメータの定量分析を可能にする、などの継続的かつストールフォーク、複製起点の密度だけでなく、フォークの終了など、すなわち複製構造。最後に、実験手順は、達成することができます。日以内ED、そして唯一の一般的な臨床検査機器や蛍光顕微鏡が必要です。
我々は、単一分子レベルでのS相中にDNA合成に影響を与えるパラメータの定量分析を可能にする方法を説明します。過去10年間で、DNAの繊維のフルオログラフィー法の異なるバージョンは、生きた細胞内の個々の複製フォークの動きを可視化するために開発されました。すべてのこれらの技術の重要なパラメータは、十分に分離されたDNAの繊維を提供するガラス表面上にDNAの伸縮可能な限り最高を達成するために使用されるプロシージャです。これを達成するための重要なステップは、顕微鏡スライド上に細胞懸濁液だけでなく、溶解時間のインキュベーション時間です。これらのパラメータは、特定のラボでの温度と気流に依存し、経験的に決定されるべきである。 DNAの繊維の実験の実用的な部分は、通常1日以内に行われます。しかし、その後の画像の取得と解析は、より多くの時間がかかり、練習が必要です。
ラベリングのプロトコールは、広告することができます様々な科学的問題に答えることをapted:秒パルスラベリングの間のレプリケーションに干渉するエージェントを使用すると、フォークの伸長/複製ストレスに応答して失速を監視します。このシナリオでは、最初のラベルは、第2ヌクレオチドを過剰に添加されるとして洗浄する必要はありません。また、複製を阻害する薬剤を組み合わせてまたは単に最初のラベルの添加後に使用することができます。これは最初のラベルと第二のヌクレオチドアナログが適用される前に削除される薬剤を必要とします。この手順では、1つは、複製ストレスの条件(すなわち、フォークが失速および/または崩壊)の下で複製フォークの安定性/回復に関する様々なDNA修復因子の重要性を決定することができます。注目すべきは、DNA複製プログラムの細目のより詳細な分析は、コーミングDNAと蛍光in situハイブリダイゼーションを組み合わせた代替アプローチを用いて行うことができた。しかし、これは技術的に、より困難であると高価が必要ですsive機器。
定性的および定量的DNA複製の明細を分析する能力は、DNA複製自体の欠陥だけでなく、複製フォークに関連付けられているゲノム不安定性を抑制する経路を調査するための不可欠なツールを提供しています。間違いなく、このアッセイは、さらに正常な細胞はがん細胞がこれらのメカニズムは、複製フォークを標的薬の毒性に抵抗するために利用する方法だけでなく、環境変化への対応/適応できるよう、レプリケーションを介したDNA修復のメカニズムに光を当てるのに役立ちます。
The authors have nothing to disclose.
我々は、繊維の技術だけでなく、有用な議論のための研究室のメンバーとの助けのために博士T. Helleday博士とE.ピーターマンに感謝。 WNは、国際がん研究のための協会からシニアの国際特別研究員による科学研究助成金(N301 165935)のためのポーランド国家委員会によってサポートされています。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
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Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA | A15-151 | |
Chicken serum | Sigma | C5405 | |
Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU) | Sigma | C6891 | |
Microscope slides SuperFrost | VWR | 631-0910 | |
Cover slips No1 | Scientific lab suppplies | MIC3234 | |
Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
sheep anti-mouse Cy3 | Sigma | C2181 | |
goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 | |