Summary
Tek hücreli ifade profil, tek tek hücrelerin ayrıntılı gen ekspresyon analizi sağlar. Biz kardiyomiyositlerde izolasyonu için yöntemler tanımlamak ve belirli hedeflere bütün transcriptome mikroarray veya qPCR için lizatları hazırlanıyor.
Abstract
Çok sayıda araştırma, kalp doku homojenatlarında gen ekspresyonu değişiklikleri incelenmiş olsa da, bu bir doku içinde hücrelerin arasında doğal bir stokastik değişim eğitim engeller. İzolasyon fare kalpleri bir kollajenaz perfüzyon yoluyla saf kardiyomiyosit popülasyonlarının tüm transcriptome gen ekspresyonu için tek bir hücre microarrays nesil veya nanofluidic dizileri kullanarak belirli hedefleri qPCR kolaylaştırır. Biz burada kalp izole kardiyomiyositlerde tek hücre gen ekspresyon profillerini incelemek için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu paradigma, değerlendirme gen ekspresyonu (Şekil 1), geleneksel tüm doku iş akışlarını kullanarak zaman mümkün değildir (örneğin bir doku içinde hücrelerin arasında varyans için) ortalama bağımlı değildir faiz ölçütlerinin değerlendirilmesi için izin verir. Biz, microarrays i kullanımını kolaylaştırır çift zincirli cDNA tek bir hücre transcriptome getirili mikrogram sağlam amplifikasyon elde etmişndividual hücreleri. Prosedürde, kullanım kolaylığı ve yeteneği kendi tasarım özelleştirmek için seçilmiştir NimbleGen dizilerin kullanımı açıklanmaktadır. Alternatif olarak, bir ters transkriptaz - belirli hedef amplifikasyon reaksiyonu (RT-STA), nanofluidic PCR ile hedefleri yüzlerce qPCR sağlar. Bu yaklaşımların birini kullanarak, bu hücreler arasında ekspresyon farklılıklarına yanı sıra bir doku içinde nadir hücre tiplerinin ekspresyon profilleri incelenerek incelemek mümkündür. Genel olarak, tek bir hücre gen ekspresyon yaklaşımı, potansiyel olarak tüm dokularda üretilen tipik homojenatlarında hücreleri milyonlarca ifade incelerken genellikle ortalaması alınır kendine özgü ifade profillerinin belirlenmesi veri üretimi sağlar.
Protocol
1. Adım 1 - kardiyomiyosit izolasyon
- Aşağıdaki gibi sindirim tampon hazırlayın:
10 x Sindirim Buffer (ultra-saf H 2 O yapılan)Final Conc. g / L g/500 mL 10x çözüm g / L NaCl 130 mm 7,597 3,3 75,97 KCl 5 mM 0,4 0,2 4,0 Pirüvik asit 3 Nm 0,33 0,165 3,30 Hepes 25 mM 5,96 2,85 59,6 MgCl 2 0.5 mM 0,101 0,05 1,01 NaH 2PO 4monobasic 0.33 mM 0,04 0,02 0,40 Dekstroz 22 mm 3,96 1,98 39,6
NaOH ile pH tampon 7.4 - 10x Sindirim Tampon kullanarak, (ultra saf H 2 O) perfüze olacak her kalp için aşağıdaki dört çözümler olun:
Sindirim Tampon A (üç alikotları bu çözümleri olun)
- 50 ml içeren 1x Sindirim Tampon:
- McL 75 - EGTA çözüm (100 mM EGTA)
Sindirim Tampon B (bunlardan biri olun.)
- 25 ml içeren 1x Sindirim Tampon:
- 1.25 mcL - CaCl 2 Çözüm (1 M)
- 1 mg - Proteaz
- 25 mg kollajenaz (can de ** = 18,75 mg bu miktarın% 75)
Koleksiyon Tampon (bunlardan biri olun.)
- 2.5 mL içeren 1x Sindirim Tampon:
- 1.25 mcL - CaCl 2 Çözüm (1 M)
- 0.5 mg - Proteaz
- 15 mg kollajenaz (% 75 = 11,25 mg) **
- 125 mg - BSA
Nötralizasyon Yıkama Tamponu (bunlardan biri olun.)
- 25 ml içeren 1x Sindirim Tampon:
- 6.25 mcL - CaCl 2 Çözüm (1 M)
- 250 mg BSA
** Kollajenaz kaynak ve toplu bağlı olarak, enzim aktivitesi değişebilir. Bu aşırı-sindirim önlemek için bu tampona eklenen enzim miktarını optimize etmek için gerekli olabilir.
- D önceden açıklanan izolasyon sistemi kurunSindirim Buffer üç 15 ml bardak ile 1,2 etail buz üzerinde, biri 50 ml tüp Sindirim Tampon A ve (Sindirim Tampon hattı üzerinden en az 5 ml yıkanmalıdır perfüzyon için hazır 25 ml Sindirim Tampon B sistem üzerinden çalıştırmak), Koleksiyon Tampon sıcaklığı 37 ° C ve Nötralizasyon Yıkama Tamponu RT yükseltmek için bir su banyosunda ısındı.
- Perfüzyon kanülü kalp kanül üst kısmının etrafında düğüm soğuk Sindirim Tampon A. ile gevşekçe bazı sütür (4-O 6-O boyutu) temizlenmeli ve perfüzyon ucuna bağlanmış olacak ve diseksiyon çanak doldurun. Bu, daha sonra aort kalp kanül kapalı kaymasını önlemek için tutmak için kullanılır.
- Ölümcül oturaklı, anestezik ajan (0.25 ml sodyum pentobarbital çözüm) bir IP enjeksiyonu ile fare ve fare sağlamak, bilinçsiz ve ağrı uyaranlara yanıt vermeyen. Diyafram keserek göğüs kenarı boyunca göğüs boşluğu dikkatlice kesilerek açılır.(Şekil 2). Yukarı süperiora kesin ve (bu kesiler sırasıyla Şekil 2, B ve A belirlenir) ön göğüs kafesi yansıtacak Kritik - fare hala bu kesiler önce nefes olmalıdır.
- , Plastik bir pipet kesim boyutu kullanarak, kalp pipet yavaşça emer. Göğüs boşluğunun yeterli aort aort dalı (Şekil 3) net bir şekilde belirlemek için kalp bırakmak dikkatli olmak kalp kesin. Kalbe az hasara neden olur bu yana bir pipet kullanılır.
- Bırak, buz gibi Sindirim Buffer bir behere kalp ve kan uzakta durulayın. 15 sonra buz Sindirim Tampon ikinci behere 45 sn yerde kalp kısaca tekrar durulama. Ayrıca soğuk Sindirim Tampon A. ile dolu petri kalp transfer
- Diseksiyonu kapsamında Sindirim Tampon çanak kalp ve aorta ve dalları dikkatlice izole. Dikkatle son bayileri sadece alt Döşemeh (Şekil 4).
- Fit aort içine kanül ucu ve 4-O bir diseksiyon mikroskobu altında sahne kurulumu kullanarak 6-O sütür içinde Arter. Kanül çok düşük aort içinde oturmak ve koroner arterler (Şekil 4) yukarıda kalır değildir ki emin olun.
- Sindirim Tampon A perfüzyon kurulum akan ile kurulum perfüzyon ucu ve kan çoğunluğu kalp açık bırakarak kalp ve sıvı yıkanır kadar kalp serpmek başlar. Kritik - perfüzyon sıvısının sıcaklığı mümkün olduğunca yakın 37 ° C olmalıdır kateter çıktığında. Çözüm çok sıcak veya çok soğuk ise, perfüzyon doku öldürecektir. Kalp perfüzyon kadar zaman da önemlidir. Perfüzyon başlayana kadar zaman penceresi kalp kaldırılması 5-10 dakika daha az olmalıdır. Kalp, anestezi altında kaldırılır, CO 2 affixation veya servikal dislokasyon olmamak gerekir .
- Bir kez kan oldukalpten hed, Sindirim Tampon B kalp akan olduğunu Sindirim Tampon A. Sindirim Tampon B geçmek olun. Çözüm sarı bir renk tonu var başlayacaktır. Kalp şeklini kaybetme belirtileri gösterir ve sindirim çalışma olduğunun bir göstergesidir yuvarlak bakmak başlayıncaya kadar 2-3 dk bekleyin. Miyokardın perfüzyon ilerledikçe hafif görünmelidir.
- 37 Koleksiyon Tampon 15 mL içeren 50 ml konik boru makası ve yer ile ventriküller Cut off ° C Koleksiyon Tampon doku yerleştirerek yavaşça, küçük parçalar halinde ventrikül kesin. Hücre-hücre yapışıklıklar çözülür ve tek bir hücre kardiyomiyosit karışımı yapmak için plastik bir pipet yardımıyla yavaşça karıştırın.
- En doku çözülür, büyük doku parçaları dibine çöken (1 dakikadan daha az). 15 ml konik boru süpernatantı alın ve kaydedin. Gravite, 10 ila 20 dakika (15 üzerinden süpernatantı bir pelet çekin.min oda sıcaklığında) tercih.
- Süpernatantı çıkarın ve atın. Pelet pelet Nötralizasyon Yıkama Tamponu 5 ml ekleyerek ve onları tekrar süspansiyon hücreleri hafifçe karıştırın yıkayın. Bu noktada hücreler hemen tek bir hücre analizi (2. adıma geçin) için seçilecek hazırız.
2. Adım 2 - tek hücre izolasyonu
- Alev ve hücreleri manipüle etmek için kullanılan bir cam kapiller tüp kullanan bir mikromanipülatör hazırlayın. Mikromanipülatör sonra taşımak ya da emme uygulanan hücreleri pick up esnek borular uzun bir parça bağlı çok ince kılcal tüp.
- Hemen çekilmiş bir pipet ve tek hücre örnekleri örnek aktarılıyor malzeme önlemek için bir hava kilidi ile oluşturulan bir mikromanipülatör kullanarak (Nikon Eclipse TS100, 20x) mikroskop altında tek tek hücrelerin seçimi geçin. Hücre popülasyonu sağlıklı olduğundan emin olun(% 70 yaşayabilir) ve izolasyon süreci zarar veremez.
- Bireysel olarak seçilmiş olabilir, böylece küçük bir Petri kabındaki hücreler aşağı seyreltilir. Toplama hücreleri küçük hacimli (2 mcL az) hücreleri yakalamak için emin olun. Ayırt edici normal kardiyomiyosit morfolojisi (Şekil 5) sadece sağlıklı hücreleri seçin.
- Tek tek hücrelerin tek tek PCR tüpleri dibine yerleştirin ve kuru buz üzerinde hemen dondurmak. Bu hücreler, gen ekspresyon analizi için kullanılacak ° C 'ye kadar sonra -80 saklanır.
3. Adım 3A - Tek hücreli qPCR gen ekspresyonu
(Advance Geliştirme Protokolü # 30 Fluidigm) 3,4 tek hücre qPCR gerçekleştirmek için tek bir hücre gen ekspresyon Biomark Nanofluidic qPCR diziler için Fluidigm Corporation tarafından geliştirilen bir uyarlanmış bir protokol kullanır.
- Özel Hedef Amplifikasyon (RT-STA) - Ters transkripsiyon hazırlanması. Olmak içincin, 1x DNA süspansiyon tamponu (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) 100 mcM ilgi genler (125 kadar primer çiftleri başarıyla kullanmıştır) tüm primer çiftleri tekrar süspansiyon haline getirin. Birleştirin ve her bir deney için 20 mcM daha ileri ve geri primer çiftleri sulandırmak. Son olarak, RT-STA tepki olarak yükseltilecek her bir deney için 200 nM son bir konsantrasyon ile bir çözüm tüm primer çiftleri sulandırmak. Bunu yapmak için, her bir primer çifti ve 1:100 onları sulandırmak. Örneğin, 20 mcM az 30 tahlil primer çiftleri varsa, her bir çifti (30 mcL toplam) 1 mcL eklemek gerekecektir ve ardından finale 70 mcL DNA süspansiyonu tampon ile, birimin kalan makyaj 100 mcL seyreltme hacmi.
- Astar çözümler hazırlanır Şimdi, RT-STA reaksiyonu ana karışımı bir araya getirin. Yeterli yükseltmek isteyen tek tek hücrelerin her biri için ana karışımı hazırlayın.
Tablo 1: RT-STA master miksReaktif McL hacmi (ortalama tepki) 2x Reaksiyon karışımı CellsDirect 5,0 Üst Simge III RT Plantinum Taq mix 0,2 RT-STA Primer karışımlar (200 nM her bir deney) 2,5 Nükleazlar H 2 O (veya 1x DNA süspansiyon tampon) 1,3 Toplam 9,0 - Hemen hücrelerinin, tüpün alt kısmında konumlandırılmış olduğundan emin olmak için 30 saniye için maksimum RCF donmuş hücreleri ve santrifüj kaldırmak. Tüp 9 mcL RT-STA karışımı ekleyin ve bir PCR reaksiyonu devam edin.
- 50 ° C - 15 dakika
- 95 ° C - 2 dakika
- 18 döngüleri
- 15 saniye boyunca 95 ° C
- 604 dakika ° C
- 4 tutun ° C
- Tüpleri PCR makineden çıkarın ve reaksiyon ExoSAP-BT 4 mcL ekleyin. ExoSAP-BT, RT-STA reaksiyon aşırı astar ve enzim kaldıracak bir PCR temizleme reaktif. PCR makine aşağıdaki reaksiyon ile tüpler çalıştırın.
- 37 ° C - 15 dakika
- 80 ° C - 15 dakika
- 4 tutun ° C
- ExoSAP-IT tedavi tamamlandığında, DNA süspansiyon tamponu ile örnekleri 01:05 sulandırmak. Örnekleri şimdi qPCR analizi için hazırlanmıştır. Biz Fluidigm Gen ekspresyonu qPCR Diziler (48,48, 96,96 plakaları) ile birlikte bu malzeme kullanıyoruz. Ayrıca bu yaklaşım daha geleneksel qPCR enstrümantasyon (96 veya 384 iyi formatları) ile kullanmak da mümkündür. Ancak, bu araçların genellikle p testlerinin sayısını sınırlar çok daha fazla örnek giriş gerektirirtek bir hücre erformed.
3. Adım 3B - tek hücre Tüm transcriptome amplifikasyon ve mikroarray
Ekstraksiyon ve Amplifikasyon
- Sigma'nın WTA2 kiti (Cat # WTA2), pelet ve tek hücreleri hem de çift zincirli cDNA yükseltmek için kullanın. Tek hücreler Sigma'nın WTA2 protokol üreticinin talimatlarına göre ilk adımı ile "çıkarılan" dir. Bu ilk adım sırasında 37 kütüphane sentez tamponu ile inkübasyon ° C 5 dakika tek hücre zarı ve amplifikasyonu için mesaj "özler" bozar.
- Sigma-Aldrich WTA2 kiti kullanarak, iki turda tek hücre artırın. Üretici protokolüne göre kütüphane hazırlık adımı gerçekleştirir; WTA2 amplifikasyon 70 mcL kütüphane örnek eklemek 1 / 5
Master Mix. 25 devir için önerilen bisiklet parametreleri kullanarak örnekleri artırın. - Örnekleri Purify USIng Qiagen QIAquick PCR Arıtma Kiti (Cat # 28.104) ve "Temizleme QIAquick PCR Amplifikasyon Reaksiyonlar Standart V4" protokolü kullanarak Qiagen Kullanıcı Qiacube süreci.
- Hız vakum kullanarak saflaştırılmış örnekleri, 5 mcL Konsantre ve 17 döngüleri (WTA2 amplifikasyon protokolü ve bisiklet parametreleri tekrarladı) amplifikasyon ikinci turda geçiriliyor.
- QIAquick PCR Arıtma Kiti kullanarak örnekleri arındırmak ve üreticilerin protokole göre NanoDrop spektrofotometre ve Agilent BioAnalyzer DNA 7500 kiti kullanılarak kalite kontrol.
Etiketleme ve NimbleGen Gen İfade Diziler
- Etiket 2 mg çift NimbleGen Bir Renk Etiketleme Kiti (Cat # 05223555001) kullanarak her bir üretici protokolüne göre amplifiye hücre örneği cDNA mahsur.
- Mus musculus 12x135k, NimbleGen Gene Expression Diziler (Cat # 05543797001) göre 5 mg Cy3 etiketli örnek melezleşmeüreticinin protokolü Ording. Dizilerin örnekleri hibridizasyon sonra, slaytlar sonra yıkanır ve bir lazer tarayıcı görüntülü önce kurutulmuş olmalıdır.
- Bir lazer tarayıcı kullanarak tarama Gen İfadesi Diziler. Burada, Moleküler Cihazlar GenePix 4200A ayarları ile 100POW, Tarayıcı, ve 300-350PMT kullanın. Sonra NimbleGen NimbleScan yazılımı kullanarak her bir dizi için çift dosyaları oluşturmak ve daha sonra her bir tek hücre dizisi (tipik stabil bir şekilde ifade kardiyomiyosit transkript bir tablo, bir ek olarak dahil edilir; Tablo S1) tüm transcriptome ifade analiz.
Kalp perfüzyon iyi çalıştı, izolasyon üzerine tipik dikdörtgen morfolojisi korumak sağlıklı kalp hücrelerinin yüksek bir oranda olması gerekir. Perfüzyon devam etmedi sonra ölü hücreleri büyük bir yüzdesini (Şekil 5 görüntülerini) olacaktır. Hücrelerin doğru ya WTA2 veya RT-STA yöntemleri kullanılarak güçlendirilirn son ürünleri NanoDrop ve BioAnalyser (Şekil 6) mRNA numunelerin kalite sonraki kalite kontrol testleri geçmelidir. Mikroarray iş akışı için, bu mRNA hem NanoDrop ve Bioanalyzer tarafından test WTA amplifikasyon sonra tamamlanır. Bu analiz Temsilcisi olumlu sonuçlar Şekil 6'da gösterilmiştir. WTA2 örnekleri NanoDrop spektrofotometre okuma, Bioanalyzer (BA) yonga (Şekil 6) yanı sıra Elektroferogram okuma hem de sağlam bir amplifikasyon göstermelidir. Stably tek hücre mikroarray aracılığıyla tespit edildi genlerin bir tablo (Tablo S1) bir örnek olarak yer almaktadır. QPCR süreci için, veri kalitesi, primer setleri istenilen ürünü (Şekil 7) yükseltme olduğundan emin olmak için PCR reaksiyon sonunda bir erime adım yaparak değerlendirilebilir. Eğer doğruysa, bu eriyik bir adım belirli bir erime zirve oluşturmanız gerekir. Bu noktayı açıklamak için, nanofluidic qPCR verilerin bir alt kümesidir tepe erime t İlgi haritası gösteriliremperature (Şekil 8) 8. , Non-spesifik ürünler 5 yokluğunda sağlamak için, erime sıcaklığı bir PCR ürününün kalitesini değerlendirmek mümkündür . Bu haritada her satır, 43 ayrı qPCR testlerinin (A1-A43) test bir hücre örneği (S1-S40) temsil eder. Bu şekilde, bazı deneyleri oldukça değişkendir ve muhtemelen daha az, yüksek PCR özgüllük ile daha kararlı testleri daha güvenilir olduğu açıktır.
Şekil 1 genel bakış, tek bir hücre izolasyonu ve gen ekspresyon analizi . Bu prosedür, fare kalp cerrahi olarak çıkarılması ve bireysel kardiyomiyositlerde izolasyonu gösterecektir. Bu yordamı tartışılan yöntemlerinin tüm transcriptome amplifikasyon (WTA) sonra qPCR veya mikroarray analizi için yöntemler içerir. WTA prosedürü sonra Sigma'nın evrensel primerler bağlayıcı (B) mRNA lizis (A) ile başlarhavuzu. Bu primerler (C) ve amplifikasyon (D) faz uzantısı amplifiye malzeme mikrogram oluşturun. Bu amplifikasyon sonra (E) mikroarray prosedürü için yeterli malzeme üretmek için tekrarlanır.
Şekil 2 fare kalp kaldırmak için insizyon yerini temsili. (A) göğüs kafesinin yan duvar boyunca kesin, daha sonra göğüs kafesinin alt marjı (B) birlikte kesti. Hala yeterli aort kalp cannulate bırakarak kalbin üstünde ve altında damarlar Kesme kaldırılmasına olanak tanıyın. Görüntüler MJ Cook 6 uyarlanmıştır.
Şekil 3 fare toraks diyagramı. Noktalı çizgiler h zarar vermeden kalp göğüs boşluğu eksize insizyon (A) yerleri gösterir eart doku. Görüntüler MJ Cook 6 uyarlanmıştır.
Şekil 4. arkus aorta ve dalları Resim. Gri çizgi aorta (A) Döşeme nerede ideal bir yer olduğunu gösterir. Kanül (B) ucu aort içinde uygun seviyeye (C) gider böylece kalp takılı kalan aort kanüle edilmiştir. Görüntüler F. Gaillard 7 uyarlanmıştır.
Şekil 5 gen ekspresyon analizi için tek bir hücre seçimi. Her panel, ışık mikroskobu altında kardiyomiyositlerde tipik morfoloji gösteren görüntülü kardiyomiyositlerde gösterir. Sağlıklı kardiyomiyositlerde yeşil oklarla gösterilir. Ölü ya da ölmek üzere olan hücreler kırmızı oklarla gösterilmiştir. Bu ölü hücreler, analizde kullanılan olmamalıdır.
iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "alt =" Şekil 6 "/>
Şekil 6. Kalite kontrolü WTA sonuçları tek bir hücre amplifikasyonu için. (A) NanoDrop spektrofotometre okuma WTA tepki amplifiye transkript için uygun bir Resim. (B) BioAnalyzer çip okuma üç amplifiye hücreler elde edilen sonuçları göstermektedir.
Şekil 7 qPCR amplifikasyon eğrileri (Sol grafik) ve pik sıcaklık eğrileri (sağ grafik) eritebilir. (A) kaliteli bir testte ifade sonuçlar farklı amplifikasyon eğrileri rağmen tek bir erime zirve ile gösterilir. (B), son derece değişken ekspresyon analizi için ideal değildir erime zirveleri olan fakir bir astar seti, eğriler eritin.
Şekil 8 tek hücre qPCR tepki için kalite kontrol sonuçlarıiyonları. Bu ısı haritası, bir renk skalası olarak erime sıcaklıkları görüntülemek için oluşturuldu. Her qPCR tahlil için pik erime sıcaklığı (A1-A43) 40, tek tek hücrelerin (S1-40) gösterilir. Testleri onların erime sıcaklığına göre kümelenmiş. Her bir deney için sütun aşağı bakarak, varyasyon örnekleri arasında eriyip görmek mümkündür. Bu rakam bazı qPCR testleri, diğerleri son derece değişken ve böylece tek bir hücre analizi için uygun değildir çok özel olduğunu gösteriyor.
Tablo S1 mikroarray veri Ek tablo Bu genlerin büyük bir veri kümesi üzerinde tek kardiyomiyositlerde tespit edildiği sağlamlık göre listelenmektedir . Bu gen listesi, genellikle tek bir kardiyomiyositlerde ifade gen bir dizi için algılama hassasiyeti gösterir.
Discussion
Bu yöntem, işlevsel bir sayısının yanı sıra gen ekspresyon çalışmaları için kardiyomiyositlerde üretme imkanı vardır. Tek hücre gen ekspresyon analizi muayene filizlenmekte olan bir alandır. Transkripsiyonel seviyeleri tek hücre düzeyinde inceleme avantajı tüm doku preparatları mümkün değildir saf bir hücre popülasyonu, muayene izin vermesidir. Ayrıca, tek bir hücre analizi, homojen 8,9 olduğu düşünülen hücre popülasyonlarının tanımlamak için, tek tek hücrelerin mRNA düzeyleri stokastik değişim incelenmesi için izin verir. Potansiyel, gen ifadesi 10,11,12 stokastik olan genlerin belirlenmesi amacıyla ek olarak, bu yöntem aynı zamanda gen ekspresyon profilleri tarafından tanımlanan nadir bir hücre popülasyonlarının belirlenmesi için olanak sağlar .
Bu yöntem, bir dizi gen ekspresyon analizi heyecan verici potansiyelini kullanır sağlarken, som var.tek hücre kullanımı e uyarılar ve dikkate alınması gereken noktalar. Tek hücre analizi için birincil sınırlama, örnek varyansı, faiz metrik konusunda istatistiksel anlamlılık elde etmek için deney yeterli hücre toplanması. Ilgi dokusundan izole edilen hücrelerin sayıları bir sınırlama değildir, bir yeni nesil sıralama ya da nanofluidic diziler gibi yaklaşımlar kullanarak, yüzlerce grup başına hücre inceleyebilirsiniz. Ancak, bazı durumlarda, yeterli ilgi doku hücreleri elde zorluk olabilir. Bu bölüm hedeflenen hücre tipi toplanması için kendine özgü yoğun bir usul ile neden olabilir. Ancak, dikkatli bir planlama ve ön hazırlık, tek bir hücre koleksiyonu ile devam hala sınırlı teknik hata ile sıkı tek hücre analizi için izin verebilir. Dikkate alınması gereken sonuçlar incelendiğinde, tecrit hücreleri için bu yordamı, çok sayıda Studie kullanılmış olsa bile(mikroskopi, elektrofizyoloji, vb dahil), yalıtım kendisi potansiyel gen ekspresyonu etkisi olabilir. Biyolojik örnekler işliyorsa herhangi bir yöntem olduğu gibi, bulguların sonuçları dikkatle tek hücre, doku kendisi ve teknik değil eğilim temsilcisi sağlamak için doğrulanmış olmalıdır. In situ hibridizasyon gibi yöntemler, sağlam doku, bu sonuçları doğrulamak için yararlı olabilir. Son olarak, üretilen verilerin dikkatli bir şekilde kalite kontrolü için işaretli olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir. Şekil 8'de gösterilen veriler qPCR deneyleri, kendi özgünlüklerini tahlil # 13 (A13) gibi çok güçlü veya tahlil # 34 (A34) gibi teknik değişikliğe yol açabilir değişkenlik yüksek seviyesine sahip olduğunu gösteriyor.
Acknowledgments
Yazarlar, bu protokolün çekimler sırasında C. Zambataro teknik yardım kabul etmek istiyorum. Biz Glenn Nathan Şok Merkezi ödülü Tıbbi Araştırma (SM), Hillblom vakıf, ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Vakfı (P30AG025708) ve PO1AG025901 destek minnetle kabul etmiş sayılırsınız. JMF Yaşlanma Araştırma Enstitüsü Buck layık T32AG000266 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
| NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase, Type I | Worthington Biochemical | C9891 | |
| 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, Inc. | PN T0221 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
| ExoSAP IT | Affymetrix | 78201 | |
| CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
| SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
| RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
| Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
| BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent Technologies | 7500 kit | |
| One Color Labeling kit | Roche Group | 5223555001 | |
| Mus Musculus 12x135k array | Roche Group | 5543797001 | |
| GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
| TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |
References
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).
- Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50 (4), 262-270 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).
- Gaillard, F.
- Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).
- Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).
- Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135 (2), 216-226 (2008).
- Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
