1. Beredning av låg-fouling bakgrund Väg upp 2 g av poly (hydroxietylmetakrylat) (PHEMA) (Sigma – cellkultur testas) i en 50 ml centrifugrör. Lös i 50 ml 95% (volym / volym) etanol i vatten. Detta tar normalt 24 timmar av sonikering. Dip-coat epoxifunktionell glasskiva (Genetix) med PHEMA lösningen. Epoxigrupperna kommer snabbt bilda kovalenta bindningar med PHEMA beläggningen. Doppbeläggning uppnås genom att hålla glasskivan med pincett och doppa sliden i lösningen. Typiskt 5 mm av sliden lämnas obelagd, som är användbar för orientering av sliden och kan också fungera som en positiv kontroll som en vidhäftande yta. Sliden är sedan bort från PHEMA lösningen under en period av 1 s, inverteras och lämnas att torka i en nära horisontellt läge under 10 minuter innan de placeras i en hållare. PHEMA belagda objektglas lämnas sedan vid atmosfäriska betingelser under 1 vecka för att medge fullständig förångning av than lösningsmedel. 2. Beredning av monomerlösning Väg 120 mg av fotoinitiatorn 2,2-dimetoxi-2-fenylacetofenon och lägg till 3 ml dimetylformamid (DMF) för att göra en 4% (vikt / volym) lösning fotoinitiator. Detta görs bäst färska före varje upplaga, så massan och volymen av färdig lösning kan varieras för att passa hur mycket fotoinitiator lösning krävs. Lösningen är stabil upp till en månad. Monomerlösningar framställs genom att tillsätta 1 del av fotoinitiatorn lösningen till 3 delar av den rena monomeren. Detta uppnås genom att pipettera 5 | il av fotoinitiator-lösning och 15 | il av monomeren i en 384 väl källplatta. En total volym av 20 | il är idealisk för fläckbildning. Högre volymer kräver ytterligare blotting innan enhetliga fläckar kan produceras. Mindre volymer kan resultera i ofullständig belastning av tappen. Denna metod är för närvarande begränsad till användningen av akrylat / metakrylatmonomerer som är lösliga i DMF genom VIrtue av dessa är de enda kombinationer som har utforskats, akrylamider och andra lösningsmedel kommer sannolikt att vara mottaglig för tryckprocessen. För att uppnå monomerkoncentrationen föreslagit (75% vikt / vikt) flytande monomerer även krävs, även om lägre monomerkoncentrationer kan användas för fasta monomerer (den reducerade monomerkoncentrationen inte verkar ogynnsamt förändra ytkemin hos den erhållna polymeren är det dock sannolikt att molekylvikten och glasövergångstemperatur förändras). Höggradigt flyktiga monomerer är också svåra att använda på grund av den snabba förångningen av monomeren före den UV-härdande steg när polymerisering. Beroende på antalet monomerlösningar en körning kan ta så länge som 6 timmar och mot slutet av körningen flyktiga monomererna kommer att ha avdunstat från källan plattan. Användning av flyktiga monomerer kan uppnås genom kylning av tryckeriet och med korta upplagor endast. Med undantag av ett fåtal mycket hydrofila monomerersåsom poly (etylenglykol) akrylat, upplösningen av den resulterande polymeren fläckarna i vattenhaltiga buffertar har inte observerats, sålunda, är användningen av en tvärbindande monomer inte krävs, men är inte uteslutet. 3. Polymer microarray bildning Det typiska förfarandet för polymer-bildning microarray visas schematiskt i figur 1. Microarray bildning uppnås med hjälp av en kontakt robot (Biodot) med användning av en XYZ-steg (figur 2). Slitsade stift 220 nm diameter används (Arrayit 96B). Alla stift bör rengöras med ultraljud i diklormetan under 10 minuter före upplaga och likaså stiftet innehavaren bör också rengöras. Stift laddas in i hållaren, blotting och array objektglas laddas och sedan hela kammaren är fylld med argon för att reducera syrehalten till under 2000 ppm, vilket är tillräckligt låg för att undvika släckning av polymerisationen radikaler av syre. Luftfuktigheten är maintained till mellan 30-40%. Inklusive fuktighet tillåter PHEMA sväller tillåter den bildade polymeren att tränga PHEMA skiktet och bli fysikaliskt infångas till ytan 2. Trycket körningen påbörjas. Varje körning består av: Laddar prov från källan plattan. Stiften sänks in i lösningarna vid en hastighet av 25 mm / s, som hölls i lösning under 2,5 s och sedan ut vid en hastighet av 25 mm / s (fig 2). Stift måste läskas före utskrift avlägsna monomerlösningen från utsidan av tappen. Därefter monomer leverans sker från den quilled delen av stiftet för att uppnå konsekvent fläckbildning. Den blotting sekvens som används består av 33 kontakt med en ren glasskiva. För de första fyra positionerna antalet gjorda kontakter är 10, 5, 4 respektive 3. De nästa fyra positionerna 2 kontakter knyts och under de senaste 3 lägen 1 kontakt. Total kontakttid för varje kontakt är 10 ms och förhållningssätt och tillbakadragande hastighet är 175mm / s. Genom denna punkt de bildade fläckar bör ha en enhetlig form och geometri. Fel vid denna tidpunkt visar orena stift eller damm föroreningar i monomeren lösningarna. De monomerlösningar därefter trycks på PHEMA belagda glasskivor (figur 2). En kontakt sker per fläck vid ett stift rörelse på 175 mm / s och kontakttid av 10 ms, vilket beroende på viskositeten och ytenergi av monomerlösningen ger en genomsnittlig fläckdiameter av 400 um. Typiskt 3 upprepade arrayer trycks på varje glasskiva och totalt 10 bilder skrivs ut på en enda körning. Detta motsvarar 30 platser per cykel. Stift tvättas i DMF. 2,5 L av färsk DMF tillhandahålls för hela tvätt körningen. Stift tvättas i ett flöde bad med omrörning. Parallellt med tvätten, de nytryckta objektglasen bestrålades med en kortvågig UV (365 nm)-källa med en densitet på 30 mV / cm 2 under hela tvätt period som varar 30 sekunder. ENfter alla monomerlösningar trycks uppsättningarna bestrålas med UV (365 nm) för ytterligare 10 minuter. De nytryckta arrayer hålls vid lågt tryck (<50 mTorr) under 1 vecka för att avlägsna opolymeriserade monomer och lösningsmedel. 4. Hög genomströmning ytkarakterisering (HTSC) Ett allmänt system för HTSC teknikerna visas i figur 3. Centralt för den automatiserade, hög genomströmning metod är inriktningen av polymeren microarray med karakterisering apparaten. I samtliga fall uppnås detta med hjälp av en kamera som ger en topp vy av matrisen. Initialt är arrayen roteras för att anpassa med XY rörelse scenen. Ett hörn plats i arrayen sedan placerade och utformade specifika koordinater. Positionen av varje polymer fläck kan därefter förutsägas med dimensionerna i uppsättningen. Vattenkontaktvinkel (WCA) mätningar WCA mätningarna utförs med den fastsittande släpp-metoden på enautomatiserad Kruss DSA 100 instrument. En enda droppe vatten med en volym av ~ 400 pL utmatas med användning av en piezo-driven skrivhuvudet på varje polymer fläck. Diametern av en polymer fläck är typiskt 300 | im och basdiametern av vattendroppen på polymer platsen är typiskt 100 um, sålunda kan endast en mätning kan erhållas per polymer-fläck. Ett XY-steget möjliggör automatisk positionering av varje polymer fläck under skrivhuvudet 7. Detta uppnås med hjälp av en kamera placerad ovanför provet som ger en topp vy av matrisen. Initialt måste kamerans position justeras för att anpassa utlämnandet av vattendroppen till centrum av kamerans vy och sedan uppsättningen kan anpassas till skrivarhuvudet. En höghastighetskamera registrerar sidoprofil av droppen vid träffar ytan och därefter indunstning. Ramen som fångar den initiala effekten av droppe används för att mäta kontaktvinkeln. En cirkel är monterad på nedgången profile och kontaktvinkeln bestäms senare. Time-of-Flight Secondary lon Mäss Spectrometry (ToF-SIMS) Prov laddas på scenen. Detta innebär för det första foder scenen med rent Al-folie, som hjälper till med laddning ersättning och sedan hålla bilden på plats genom användning av flikar plåtskruven. Prov steg placeras i överföringen kammare ToF-SIMS och får pumpa tills 1,6 × 10 -6 mbar. Provet överförs sedan till den huvudsakliga analysen kammare, som typiskt har ett vakuumtryck av 1,0 x 10 -8 mbar. TOF-SIMS mätningarna utförs med en jon-TOF IV instrumentet manövreras med en monoisotopisk Bi 3 + primär jonkälla drivs vid 25 kV i "knippen läge". En pulsad 1 pA primär jonstrålen rastered över analysen området, med både positiva och negativa sekundära joner uppsamlade från en 100 x 100 | im område av varje polymer plats i mikromatris för en 10-sekOND insamlingstid. Ion massorna bestämdes med användning av en högupplösande Time-of-Flight analysator tillåter exakt massa uppdrag. Den typiska massa upplösning (vid m / z 41) var drygt 6000. Lågenergielektroner (20 eV) användes för att kompensera för ytan laddning orsakad av den positivt laddade primära jonstråle på de isolerande ytorna 8. Atomkraftsmikroskopi (AFM) En stor scen AFM med ett automatiserat steg krävs för att analysera arrayer på glasskivan. En dimension eller ikon mikroskop är perfekt för detta ändamål. Provet placeras på scenen och scenen position homing till övre högra hörnet av matrisen. Placeringen av det nedre vänstra hörnet av matrisen hittas tillåter vilken position alla andra platser att interpoleras. En position lista genereras och matas in i automatisk provtagning i programvaran. AFM mätningar utförs enligt en NanoScope 3000A instrument knacka mode. Silicon tips med en resonansfrekvens på ungefär 300 kHz och en styrka av konstant 40 N / m användes (Tap300Al, Budget Sensorer). 5×5 um regioner av polymeren mäts 9. Det kvadratiska medelvärdet (RMS) ojämnhet mäts över denna region för varje bild med SPIP programvara batchbearbetning. Varje bild är från början tillplattad innan ojämnhet mätningar. Alla bilder kräver en manuell visning för att identifiera imaging artefakter som kan behöva tas bort från ojämnhet mätningar. Under detta steg bilder kan också kategoriseras baserat på gemensam yta funktioner 9. Röntgen fotoelektronspektroskopi (XPS) En microarray bild är fäst på ett prov bar med dubbelhäftande tejp och därefter laddas in i provkammaren en Kratos Axis Ultra XPS instrumentet. Gå in provkammaren och vänta tills den når ett tryck under 10 -8 Torr. Lämplig funktionparametrar, såsom en monochromated röntgenkälla (Al, 1486,6 eV), anod potential och ström (10kV och 15mA), bländare storlek (110μm), Godkänd energi (80 eV för bred skanning och 20 eV för hög upplösning skanning) är valts. Röntgen källa fokuserad med två motsatta hörn av mikromatrisen och optimera syret signalen från provet. X-och y-positioner individuella fläckar bestäms sedan och loggas som en ställning lista. Ett program diagram skrivs och sedan köra för förvärvet av data, inklusive det breda skannar och höga skannar upplösning för specifika element. Raman-spektroskopi Raman spektra tas för varje polymer fläck med en ramanmikroskop LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon). Initialt Ramansignalen kalibreras med användning av en kiselskiva och Raman förskjutning av Si vid 520,7 cm -1. Provet placeras sedan på scenen och i fokus för laser (våglängd = 523 nm) justeras för att maximera CH Raman skiftvid 2950 cm -1. Positionen för centrum av den övre vänstra platsen på microarray sedan in som ursprung och en karta över microarray är inställt med arrayen funktionen på labRAM HR programmet. 10 spektra förvärvas kumulativt för varje prov med en bestrålningstid av 0,5 sekunder. 5. Bakteriell analys Matrisen kan utsättas för många olika biologiska analyser, inklusive fastsättning och proliferation av stamceller, andra celler typer och bakterier 3,10,4. Här beskriver vi en bakteriell infästning analys, vilket visas schematiskt i figur 4. En bakteriestam transformerad med GFP uttryckt plasmid odlas över natten vid 37 ° C i 10 ml LB-medium i en 50 ml Falcon-rör med skakning vid 200 varv per minut. OD 600 av bakteriekulturen mäts och tillräcklig natten kulturen ympades i 15 ml definierade RPMI-1640 medium för att ledai en slutlig OD 600 av 0,01. Arrayer förtvättades i steriliserat destillerat vatten för 10 minuter för att avlägsna eventuella lösliga komponenter från uppsättningarna (unpolymerised monomer, oligomerer och lösningsmedel) Tvättade array bilder placeras i en ren petriskål och UV steriliseras i 10 min. En bild med matrisen placeras i en petriskål och 15 ml av de inokulerade RMPI-1640 medium tillsätts. Samtidigt annan bild placeras i en petriskål och inkuberades med icke-innoculatd RPMI-1640 som en kontroll. Objektglasen inkuberas vid 37 ° C under 72 timmar med skakning vid 60 varv per minut. Objektglasen tvättas två gånger med 15 ml steril PBS. Objektglasen tvättas två gånger med 15 ml sterilt destillerat vatten. Bilderna är lufttorkas. Diabilder avbildas med en GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, USA) med en 488 nm excitation laser och standard blå emissionsfilter (510-560 nm). En representativ polymer autofluorescens bild ärvisas i figur 2. Detta bör göras så snart som möjligt för att undvika förfall GFP. Om detta inte är möjligt bör de celler genomgå fixering. Vidare är införandet av lämpliga positiva kontroller med en känd bakteriell svar absolut nödvändigt att kunna normalisera resultaten och tillåta experiment utförda på olika dagar för att vara kvantitativt jämförbara. Den totala fluorescensintensiteten från polymera fläckar förvärvas med GenePix Pro 6 programvara (Molecular Devices, USA). Detta görs för båda bilderna inkuberade med bakterier och bara media. För att hitta den fluorescens på grund av tillväxt av bakterier fluorescensen på mediakontrollen subtraheras från fluorescensen mätt på objektglaset inkuberas med bakterier. Objektglas kan också färgas med 20 M SYTO17 nukleinsyra färgämne (Invitrogen, Storbritannien) vid rumstemperatur i 30 minuter och avbildas med en Carl Zeiss LSM 700 laserskanning mikroskop med ZEN 2009 bildbehandlingsprogram (Carl Zeiss, Tyskland). Täckningen av bakterierpå ytan bestäms med öppen källkod Image J 1,44 mjukvara (National Institute of Health, USA). 6. Representativa resultat Villkoren för utskrift har optimerats för att skriva ut de högsta mikroarrayer kvalitets polymer. Fuktigheten bör hållas på mellan 30-40%. Delamineringen av polymera fläckar i vattenhaltiga miljöer observerades ofta för arrayer tryckta vid en fuktighet under 30%, vilket tyder på att denna fukt är otillräcklig för att svälla PHEMA skiktet och möjliggöra för den fysiska infångningen av polymeren till substratet. Fuktigheten kan ökas ytterligare för att ändra diametern hos de polymera fläckarna, men detta beror på monomeren kemi. Till exempel, där lika volymer av polymerisationslösningen trycktes och som fukt ökades från 40 till 80% av fläckdiameter minskade från 430 ^ m till 370 | im för en monomer innehållande en hydrofil etylenglykol grupp lika volym medan den för en monomer innehållande en hydrofob alifatisk struktur kolring plats diametern ökade från 290 ^ m till 350 | im (figur 5). Graden av polymerisation kan övervakas med användning av Raman-spektroskopi för mätning av C = C Raman skift som detekteras vid 1640 cm -1, som bör normaliseras med C = O Raman skift vid 1720 cm -1. Raman-spektra mättes för polymera fläckar polymeriserade för varierad UV-exponering (figur 6). C = C: C = O-förhållande minskade UV-exponering ökade från 0 till 50 s, varefter ingen ytterligare minskning i C = C: C = O-förhållande observerades med ytterligare UV-bestrålning (Figur 6). Raman-spektra mättes även för polymera fläckar polymeriseras vid varierande O 2 nivå och C = C-Raman-skift observerades O 2 nivån minskade till 2000 ppm, men ingen ytterligare minskning observerades för en O 2 nivå under detta (Figur 7A ). Ramanspektroskopi visade också förmågan hos vakuumextraktion sTEP att avlägsna opolymeriserad monomer. Före sugklocka C = C-Raman skift var större för polymeren polymeriserades vid 3300 ppm jämfört med 2000 ppm (figur 7A), emellertid, efter sugklocka höjden av den Raman-skiftningen är särskiljas (figur 7B), vilket antyder alla opolymeriserad monomer har avlägsnats under vakuum extraktionssteget. Sammanfattningsvis, polymerisationsbetingelser inkluderar en fuktighet av 30-40%, UV-exponering är större än 50 s vid en O 2 nivå under 2000 ppm med ett vakuum extraktionssteg efter utskrift för 7 dagar. Efter tryckning och sugklocka framgång polymerisation av polymera fläckar kan bedömas genom en enkel ljusmikroskop för att identifiera och onormala morfologier plats. Typiskt bör fläckar cirkulär och jämn, såsom visas i figur 8 till vänster. Den troliga orsaken till en förändring i geometri är en skadad eller oren stift. För ett litet antal monomera kombinationer vi sett missbildade fläckar, för example en central plats med en satellit små fläckar, som visas i figur 8 till höger, eller ett stekt ägg form där det finns en central plats på toppen av stora plattare plats. Detta kan orsakas av fasseparation före utskrift avseende skillnader i viskositet, hydrofilicitet, flyktighet eller ytspänning av monomererna och föreslår att monomeren kombinationen inte är kompatibel med detta format. Ytterligare kemisk kartläggning av polymera fläckar av tekniker såsom ToF-SIMS är också en viktig och ibland nödvändigt kvalitetskontroll steg för att bestämma fördelningen av material "kemiska över fläckarna och matrisen. Denna teknik kan identifiera överdriven spridning av vissa material inte synliga i ljusmikroskop och identifiera fasseparation inom enskilda polymer fläckar. Figur 1. Schematisk visar de olika steg som ingår i bildandet av en poLymer plats. Figur 2. Schematisk av metodologin av tappen tryckning involverar initialt laddas stiftet med monomer i en källplatta och därefter avsätta monomeren på ett substrat genom att ta kontakt. Stiftet styrs av en XYZ robotarm. Den infällda bilden visar en typisk bild av autofluorescens från en array efter produktionen. Figur 3. Schematisk belyser de tekniker som är förknippade med HTSC och även bioanalyser tillämpas på studiet av polymera mikromatriser. Figur 4. Schematisk av den bakteriella fäste analysen. Figur 5. Polymer fläckdiameter tryckt vid varierande luftfuktighet för två olika monomerer: 4-tert-butylcyklohexyl akrylat och di (etylenglykol) etyleter metakrylat. Figur 6. Förhållandet mellan Raman-intensiteten för C = C-Raman skift vid 1640 cm -1 och C = O Raman skift vid 1720 cm -1 från polymera fläckar av 4-tert-butylcyklohexyl-akrylat med varierande UV-exponering. Felstaplarna motsvarar en standardavvikelse (n = 3). Figur 7. Raman spektra mättes för polymera fläckar av 4-tert-butylcyklohexyl akrylat tryckt på olika O 2 våningar, anges till vänster om varje spektrum (A) före och (B) efter sugklocka. Förhållandet mellan den Raman-intensiteten för C = C-Raman skift vid 1640 cm -1 och C = O Raman skift vid 1720 cm -1 </sup> visas till höger om varje spektrum. Figur 8. En ljusmikroskop bild av två polymer fläckar. Platsen till vänster visar en välformad plats, medan platsen till höger är ett exempel på en plats som innehåller ett mycket ojämnt fördelning av monomer. Skalan baren är 500 nm.